凝血酶的提取

1、凝 血 酶 的 提 取凝血酶是機(jī)體凝血系統(tǒng)中的天然成分，它由兩條肽鏈組成，多肽鏈之間由二硫鍵連接。凝血酶在體內(nèi)以凝血酶原形式存在，在肯定條件下凝血酶被激活并轉(zhuǎn)化為有活性的一種蛋白質(zhì)水解酶。分子量335800，白色無(wú)定形粉末，溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。目前國(guó)內(nèi)主要從動(dòng)物血漿及人血漿中制備凝血酶，在經(jīng)激活物激活而成為凝血酶。它可催化血纖維蛋白原中血纖維肽A和B的斷裂，轉(zhuǎn)變成不溶性血纖維蛋白凝塊。凝血酶在臨床上應(yīng)用廣泛，常以干粉或溶液局部涂于傷口及手術(shù)處，掌握毛細(xì)血管血液滲出，多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙時(shí)出血等。有時(shí)也可口服，用于胃和十二指腸出血。凝血酶局部止血效果好，且無(wú)副作用。目前凝血酶的應(yīng)用

2、范圍正日漸擴(kuò)大，由單純的局部外敷進(jìn)展到外科手術(shù)、耳鼻喉、口腔、婦產(chǎn)、泌尿及消化道等部位出血的止血，亦可作為多種外用止血藥物的重要原料，其止血效果優(yōu)于“對(duì)氨基苯甲酸”、“止血環(huán)酸”、“止血敏”等通過(guò)注射后須經(jīng)血管收縮而起止血作用的藥物，顧深受寬闊用戶的歡迎，將廣泛應(yīng)用于臨床。由于臨床使用該藥日漸廣泛，將使目前十分緊俏的凝血酶更趨緊缺，因此生產(chǎn)前景看好，只要原料有保證，技術(shù)過(guò)關(guān)，就可獲得產(chǎn)品。（一）原料及試劑：1、動(dòng)物血液：須選用新奇的動(dòng)物血液，防止混入其它雜志。盛血液的器具肯定要潔凈。2、檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O）：又名枸櫞酸鈉。無(wú)色晶體或粒狀粉末。相對(duì)密度1.875。

3、150時(shí)失去結(jié)晶水，溫度再高則分解。溶于水，難溶于乙醇。本工藝中主要作抗凝血?jiǎng)┯?，防止血液凝固。選用化學(xué)純?cè)噭?、醋酸：學(xué)名乙酸。無(wú)色澄清液體，有刺激氣味。相對(duì)密度1.049，沸點(diǎn)118。溶于水、乙醇和乙醚。用于調(diào)節(jié)pH值。選用化學(xué)純?cè)噭?、氯化鈉：白色立方晶體或細(xì)小結(jié)晶粉末。相對(duì)密度2.165，熔點(diǎn)801。味咸，中性。有雜質(zhì)時(shí)易潮解。溶于水和甘油，難溶于乙醇。選用一級(jí)工業(yè)品。5、氯化鈣：白色立方晶體，易潮解，相對(duì)密度2.15，熔點(diǎn)782，沸點(diǎn)大于1600，溶于水、乙醇。本工藝中用作激活劑，選用分析純?cè)噭?、丙酮：無(wú)色易揮發(fā)、易燃液體。有微香氣味。相對(duì)密度0.7893，沸點(diǎn)56.5。于水

4、、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿等混溶。能溶解油、脂肪、樹(shù)脂和橡膠。其蒸汽與空氣形成爆炸性混合物，化學(xué)性質(zhì)活潑。本工藝中用作沉淀劑，選用化學(xué)純?cè)噭?、乙醇：又稱酒精，無(wú)色透明易揮發(fā)、易燃的液體。有酒味和刺激辛辣味道。相對(duì)密度0.789。沸點(diǎn)78.4。溶于水、甲醇、乙醚、氯仿等。有吸濕性，能與水形成共沸混合物。其蒸汽與空氣形成爆炸性混合物。本工藝中用來(lái)洗滌凝血酶，選用工業(yè)乙醇。8、乙醚：又稱二乙醚。是易流淌的無(wú)色透明液體。有令人爽快的特別氣味，其蒸汽能使人失去知覺(jué)，甚至死亡。相對(duì)密度0.7135，沸點(diǎn)34.5。難溶于水，易溶于乙醇和氯仿等溶劑，極易揮發(fā)和著火。本工藝主要用于洗滌凝血酶，選用化學(xué)純?cè)噭?/p>

5、使用時(shí)，操作人員應(yīng)注意防護(hù)，避開(kāi)吸入，周圍應(yīng)杜絕明火并保持空氣流通。9、草酸鉀：又名乙二酸鉀。這里用于測(cè)定凝血酶活性，選用分析純?cè)噭?0、標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白原：這里用于測(cè)定凝血酶效價(jià)，選購(gòu)藥檢部門供應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。（二）凝血酶的提取工藝：1、工藝流程：2、操作步驟：（1）分離血漿，提取凝血酶原：取動(dòng)物血液，按每千克動(dòng)物血液加3.8克檸檬酸三鈉投料，攪拌均勻，裝入離心管中，以3000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘，分出血球（可供制備血紅素），收集血漿。把血漿溶于10倍蒸餾水中，用1%濃度的醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.3，在離心機(jī)上離心15分鐘，棄去上清液，收集的沉淀物即為凝血酶原。（2）凝血酶原的激活：在30的條件下

6、，將凝血酶原溶于12倍的0.9%氯化鈉溶液中，攪拌均勻，加入占凝血酶原重量1.5%的氯化鈣，攪拌15分鐘，在4下放置1.5小時(shí)左右，保證凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶。（3）沉淀分離凝血酶：將激活的凝血酶溶液用離心機(jī)離心15分鐘，棄去沉淀。上清液移入搪瓷桶中，加入等量的預(yù)冷至4的丙酮，攪拌均勻，在冷處?kù)o置過(guò)夜，然后用離心機(jī)分離，收集沉淀，上清液可供回收丙酮。沉淀用丙酮洗滌并研細(xì)，在冷處?kù)o置3天左右，然后過(guò)濾，沉淀分別用乙醇和乙醚洗滌一次，放置在干燥器或石灰缸中干燥，即得凝血酶粗品。（4）除雜、沉淀、干燥：把粗品溶于適量（1倍左右）的0.9%氯化鈉溶液中，在0放置6小時(shí)以上，然后用濾紙過(guò)濾，濾出的沉淀再用

7、0.9%氯化鈉溶液溶解，在0放置6小時(shí)以上，過(guò)濾，合并兩次濾液，用1%醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值為5.5。然后離心，棄去沉淀，收集上層清液。在清液中加入2倍量預(yù)冷至4的丙酮，靜置3小時(shí)，離心30分鐘，收集沉淀。沉淀再浸泡于冷丙酮中，靜置過(guò)夜，然后過(guò)濾，沉淀分別用無(wú)水乙醇、乙醚各洗滌一次，干燥即得產(chǎn)品。（三）凝血酶效價(jià)測(cè)定：1、標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白測(cè)定法：凝血酶的單位定義為活度量，即1毫升標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白原溶液在28、15秒鐘內(nèi)產(chǎn)生凝集的量為一個(gè)單位。簡(jiǎn)略做法是：將凝血酶樣品配成適當(dāng)濃度，取0.2毫升加入0.8毫升0.125%纖維蛋白原溶液，于28測(cè)定其凝結(jié)時(shí)間（先將凝血酶配成肯定濃度），得到每毫克樣品所含單位的估

8、算值。在按估算值配成0.2毫升含1個(gè)單位的凝血酶溶液，取0.2毫升加入0.8毫升0.125%纖維蛋白原溶液中，凝結(jié)時(shí)間須為15秒。2、草酸鹽牛血清測(cè)定法：即1毫升草酸鹽牛血清在28、15秒鐘內(nèi)產(chǎn)生凝集則含凝血酶2.25單位。簡(jiǎn)略做法是：7份牛血清與1份等滲草酸鉀溶液（1.85%）混合，離心分離得草酸鹽牛血清（-40只能保存兩個(gè)星期）。取幾只試管，各加0.9毫升草酸鹽牛血清，依次加入不同稀釋度的凝血酶樣品溶液0.1毫升，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，確定適宜的稀釋度，使之在15秒鐘內(nèi)產(chǎn)生凝集。同前面的定義一樣，在15秒鐘消失凝集的試管含2.25單位凝血酶。估量稀釋度后，很快就可以確定凝血酶原液的滴定度及每毫升或

9、每毫克凝血酶的單位。（四）工藝評(píng)價(jià)：國(guó)外已有報(bào)道以牛血漿為原料制備凝血酶，也可用豬血漿為原料分離制備凝血酶，以達(dá)到充分利用我國(guó)豐富的豬血資源之目的。豬血中，血漿與血球之體積比為5545，通常1000毫升全血用離心機(jī)分離只能得到500毫升血漿。新奇豬血不能立即分離，需盡快冷至15以下（時(shí)間太長(zhǎng)豬血會(huì)發(fā)生腐?。?，再進(jìn)行分離。溫度愈低，血漿、血球愈容易分離。用以上工藝，每1000毫升血漿可制得凝血酶粗品約10克，凝血酶精品約0.4克。即粗品收率約百分之一，精品收率約萬(wàn)分之四。原有的凝血酶制備方法，獲得的凝血酶效價(jià)最高約每毫克干重950單位，即每毫克氮約6600單位。沃爾特等報(bào)道，經(jīng)過(guò)改進(jìn)的凝血酶制備

10、方法，其分離獲得效價(jià)為每毫克氮約12000單位的凝血酶組分。并由溶解度曲線表明制劑含有兩個(gè)明顯不同溶解度的活性組分，它們的效價(jià)分別是每毫克氮10086單位及13365單位，從而推斷凝血酶有兩個(gè)活性組分，即存在兩個(gè)天然凝血酶分子。接受一般方法制備的凝血酶通常為灰白色粉末，將其溶于生理鹽水中通常得到的是半透明膠狀懸濁液。這是由于含有雜質(zhì)的原因。若制備過(guò)程中實(shí)行了透析及硫酸銨進(jìn)行分級(jí)分離等步驟處理，凝血酶的純度將大大提高。其精品色雪白，極易溶于水，水溶液呈清透明，醫(yī)療價(jià)值更高。因此依據(jù)需要，可制備凝血酶制劑和高純度凝血酶無(wú)菌干凍品。我國(guó)豬肉資源十分豐富，血漿原料充足（平均每頭豬可回收血漿1升），血球

11、可作為制備超氧化物歧化酶及血卟啉類等的原料，且凝血酶局部止血效果良好，具有醫(yī)用價(jià)值。因此，由豬血制備凝血酶的前景是令人樂(lè)觀的。（五）市場(chǎng)分析：據(jù)了解，目前國(guó)際上僅有英、美、日等少數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家能在低溫狀態(tài)下從人或牛血液中人工提取凝血酶，但因受其生產(chǎn)環(huán)境、血源等因素制約，其產(chǎn)量很小，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)需要，其產(chǎn)品主要用于生化制藥產(chǎn)品的鑒定，很少直接用于臨床，因其價(jià)格十分昂貴，很難被用戶接受。當(dāng)前我國(guó)主要從豬血中提取凝血酶，產(chǎn)品已應(yīng)用于臨床，但由于技術(shù)緣由、原料分散等因素的制約，故產(chǎn)量也比較小，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了國(guó)內(nèi)臨床的需求。隨著凝血酶應(yīng)用的不斷推廣，用量迅速擴(kuò)大。加之世界一些地區(qū)戰(zhàn)亂，傷病人數(shù)增加，對(duì)高效

12、局部止血藥的需求更難以估量，產(chǎn)供沖突也將更為突出，市場(chǎng)價(jià)值有增無(wú)減，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)前景相當(dāng)寬闊。凝血酶是以凝血酶原的形式存在于人或動(dòng)物血液中，而我國(guó)人口眾多，屬于食肉大國(guó)，其動(dòng)物血源均白白流失，成為污染環(huán)境的一大公害。提取凝血酶既可變廢為寶，為國(guó)家創(chuàng)匯，而且還可解決環(huán)境污染問(wèn)題，所以生產(chǎn)前景是樂(lè)觀的。（六）注意事項(xiàng)：（1）動(dòng)物血液肯定要新奇，要防止血液凝固、溶血。（2）所用器具肯定要潔凈，以防影響產(chǎn)品的純度。（3）試劑配制及pH值調(diào)節(jié)肯定要精確，方可保證產(chǎn)品產(chǎn)量及質(zhì)量。（4）生產(chǎn)溫度應(yīng)掌握在規(guī)定的條件下，低溫提取，方可保證酶不失活。（七）生產(chǎn)設(shè)備及器具離心機(jī) 1臺(tái) 攪拌機(jī) 1臺(tái)布氏漏斗（9 毫米） 2個(gè) 搪瓷桶（20 升） 4只溫度計(jì)（0100） 1支 干燥器 2個(gè)天平（萬(wàn)分之一） 1臺(tái) pH試紙（114） 2本燒杯（2000 毫升） 1只 （1000 毫升） 1只 （100 毫升） 2只 （50 毫升） 2只量筒（1000 毫升） 1只 （300 毫升） 1只 （100 毫升