三種肺炎支原體檢測(cè)法的臨床應(yīng)用分析

1、畢業(yè)論文題目 ： 三種肺炎支原體檢測(cè)法的臨床應(yīng)用分析姓名：學(xué)號(hào)：專業(yè)：層次：年級(jí)：完成日期：指導(dǎo)教師：三種肺炎支原體檢測(cè)法的臨床應(yīng)用分析摘要目的 探討肺炎支原體( MP) 咽拭子快速液體培養(yǎng)法、咽拭子聚合酶鏈反應(yīng)( PCR)法和血清MP被動(dòng)凝集法(MP-Ab)等方法在兒童MP感染診斷治療過程中的敏感性方法 采用3MP檢測(cè)法對(duì)362例臨床擬診呼吸道(非細(xì)菌性)感染的患兒的咽拭子和血清標(biāo)本進(jìn)行配對(duì)研究，每患兒取咽拭子做快速培養(yǎng)和PCR，同時(shí)取血清做MP-Ab檢測(cè)，對(duì) 3 種方法的檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷治療病例進(jìn)行回顧性分析。結(jié)果回顧臨床病例診斷 MP感染患兒152例。MP快速培養(yǎng)法檢出陽(yáng)性78例，陽(yáng)性

2、率為51.3%，病程為(4.5± 2.6) 天；PCR法檢測(cè)出陽(yáng)性103例， 陽(yáng)性率為67.8%， 病程為 ( 6.2± 3.5) 天； MP-Ab法檢測(cè)出陽(yáng)性127 例，陽(yáng)性率83.5%，病程(8.1 ± 4.5)天。結(jié)論3 種 MP檢測(cè)法的敏感性與病程有相關(guān)性，臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)患兒病程選取檢測(cè)方法，以提高陽(yáng)性檢出率和敏感性。關(guān)鍵詞肺炎支原體，快速培養(yǎng)法，咽拭子聚合酶鏈反應(yīng)，血清抗體，配對(duì)研究前言肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae,MP)是嬰幼兒、青少年急道感染的主要病原體之，臨床上表現(xiàn)為呼吸道感染綜合征，其中約3% 10%可發(fā)展為支原體肺炎。

3、但只根據(jù)臨床癥狀很難鑒別由MP或病毒、細(xì)菌等病原體引起的兒童呼吸道感染，給臨床治療帶來一定的困難。筆者采用3 種 MP檢測(cè)法對(duì)362 例臨床擬診為呼吸道(非細(xì)菌性)感染患兒的咽拭子和血清標(biāo)本進(jìn)行配對(duì)研究，通過病例回顧來探索對(duì)支原體肺炎敏感的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，以協(xié)助臨床準(zhǔn)確做出診治。1. 文獻(xiàn)綜述1.1 肺炎支原體的定義小兒肺炎支原體肺炎多見于515 歲兒童，嬰幼兒患病常表現(xiàn)為毛細(xì)支氣管炎。多數(shù)為亞急性起病，發(fā)熱無定型，或體溫正常，咳嗽較重，初期為刺激性干咳，常有咽痛，頭痛等癥狀。X線改變明顯，多為單側(cè)病變，也可見雙側(cè)病變，以下葉為多見，有時(shí)病灶呈游走性，少數(shù)呈大葉性陰影；病程23 周不等，X線陰

4、影完全消失比癥狀消退更延長(zhǎng)23 周之久，偶有延長(zhǎng)至6 周者。1.2 肺炎支原體的發(fā)病機(jī)制肺炎支原體肺炎(Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia， MPP)的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，目前主要有呼吸道上皮吸附作用、MP直接侵入和免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制等學(xué)說，其中免疫調(diào)節(jié)異常在MPP的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用1.3 肺炎支原體的臨床表現(xiàn)1.3.1 多數(shù)為亞急性起病，發(fā)熱無定型，或體溫正常，咳嗽較重，初期為刺激性干咳，常有咽痛，頭痛等癥狀。1.3.2 可出現(xiàn)多系統(tǒng)多器官的損害，皮膚粘膜表現(xiàn)為麻疹樣或猩紅熱樣皮疹；偶見非特異性肌痛和游走性關(guān)節(jié)痛；也有表現(xiàn)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)損害、血尿及溶血

5、性貧血等。1.3.3 全身癥狀比胸部體征明顯。體檢肺部體征不明顯，偶有呼吸音稍低及少許干濕羅音者1.4 肺炎支原體的臨床診斷病原學(xué)診斷肺炎支原體快速鑒定培養(yǎng)法優(yōu)于被動(dòng)凝集法，在肺炎支原體肺炎感染的早期可提供重要的依據(jù)，可做為臨床診斷MP感染的優(yōu)先試驗(yàn)8 ；氣管肺泡灌洗液MP-DNA測(cè)定不僅能診斷MP感染, 且支氣管肺泡灌洗術(shù)可促進(jìn)呼吸道癥狀的改善及體征恢復(fù)，且通過纖維支氣管鏡收集支氣管肺泡灌洗液MP-DNA， 痰液MP-DNA及血清MP抗體檢測(cè)陽(yáng)性率沒有差異。CRP的檢測(cè)是肺炎病原體的輔助診斷方法，一定程度可區(qū)分細(xì)菌性肺炎和支原體肺炎。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)MP具有可靠、特異性高的特點(diǎn)

6、，逐漸成為早期特異診斷的有力武器。1.5 肺炎支原體的實(shí)驗(yàn)室檢查急性期MPP患兒血清hs-CRP、 C3、 CA、 IgM、 IgG 明顯升高，IgA 明顯降低；而恢復(fù)期hs-CR、 IgG仍然較高，而IgM 和 IgA均沒有明顯變化，補(bǔ)體C3、 C4在恢復(fù)期內(nèi)也沒有明顯變化，因此血清C-反應(yīng)蛋白、免疫球蛋白和血清補(bǔ)體的監(jiān)測(cè)對(duì)診斷急性期或恢復(fù)期MPP有重要意義。MP-IgM 和冷凝集試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)可提高小兒支原體肺炎實(shí)驗(yàn)診斷的準(zhǔn)確率；支原體肺炎患兒外周血白細(xì)胞大多正常占80%，中性粒細(xì)胞增高占61%； 65.6%患兒C-反應(yīng)蛋白增高；53.6%患兒血沉增快；58.4%患兒心肌酶譜增高；24.0%

7、患兒肝酶增高；16.8%患兒尿酸增高。5. 流行病學(xué)特點(diǎn)及進(jìn)展MP肺炎發(fā)生率約為22.3%， 9 12 歲感染率最低,3 6 歲最高 ,10 12 月是發(fā)病高峰月, 小兒支原休肺炎發(fā)病率有所上升, 發(fā)病年齡有趨小傾向, 秋冬季發(fā)病率高, 肺炎支原體只要通過呼吸道進(jìn)行傳播，尤其發(fā)病率較高的地區(qū)，局部區(qū)域每隔3-5 年可發(fā)生一次肺炎支原體感染，每2-6 年可發(fā)生一次大范圍的肺炎支原體感染，每次感染的時(shí)間都持續(xù)較長(zhǎng)，有的感染可持續(xù)一年左右，因此，有關(guān)部門一定要采取相應(yīng)的預(yù)防措施，切斷呼吸道飛沫傳播途徑對(duì)控制疾病發(fā)生和流行具有重大意義。控制支原體感染的發(fā)生和流行。6. 材料和方法6.1 樣本收集某中心

8、醫(yī)院檢驗(yàn)科2015 年 1 月 1 日 8 月 6 日在兒科就診住院患兒病例，有呼吸道感染癥狀，已經(jīng)初診為非細(xì)菌性感染的患兒362 例作為研究對(duì)象，其中男175 例，女 187 例；年齡為2個(gè)月 12 歲，病程為1 90 天。6.2 方法具體方法有：（ 1）用MP快速培養(yǎng)法、PCR法和MP-Ab法等 3 種 MP檢測(cè)法對(duì)362 例研究對(duì)象同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果。（ 2）通過研究對(duì)象病歷回顧統(tǒng)計(jì)MP感染的例數(shù)，并按年齡、病程和3 種MP檢測(cè)法結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。6.3 臨床診斷MP感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)1 、臨床癥狀、體征標(biāo)準(zhǔn)，包括回顧性診斷即患兒經(jīng)紅霉素治療有效，經(jīng)青霉素、頭孢菌素治療無效者等；

9、以及實(shí)驗(yàn)室檢查3 種檢測(cè)法至少有一種陽(yáng)性。病程計(jì)算方法：以病歷本記錄為準(zhǔn)，即在患兒開始有癥狀或體征時(shí)開始計(jì)算，到患兒來就診檢測(cè)時(shí)為止進(jìn)行計(jì)算。6.4 MP快速培養(yǎng)法支原體分離鑒別培養(yǎng)液由珠海市浪峰生物技術(shù)有限公司提供。清晨患兒未洗漱用咽拭子取咽部分泌物，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，將咽拭子用無菌生理鹽水處理，接種到預(yù)溫的培養(yǎng)基中，37 培養(yǎng)；培養(yǎng)基液體顏色由紫紅色變?yōu)椴菥G色或嫩綠色且清亮，并且在靜置時(shí)，瓶底有藍(lán)色顆?；蛭镔|(zhì)沉淀為陽(yáng)性，5 天后培養(yǎng)基顏色不變或無藍(lán)色顆?；蛭镔|(zhì)沉淀為陰性。PCR法：試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。應(yīng)用PCR法檢測(cè)MP-DNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，以在紫外燈下出現(xiàn)

10、 180 bp 擴(kuò)增帶結(jié)果判為陽(yáng)性。每次試驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照（陽(yáng)性對(duì)照為MP質(zhì)粒，陰性對(duì)照為無菌生理鹽水）， 由專人進(jìn)行操作，質(zhì)量控制。MP-Ab法：試劑為日本瑞必歐株式會(huì)社MP-Ab檢測(cè)試劑SERODIA-MYC凝集試驗(yàn)試劑盒，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，抽取患兒靜脈血 O3 ml，采用明膠顆粒被動(dòng)凝集法，用血清檢測(cè)，結(jié)果以1 40 判斷為陽(yáng)性。每次試驗(yàn)均設(shè)未致敏明膠顆粒、致敏明膠顆粒和陽(yáng)性、陰性血清進(jìn)行測(cè)定。6.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x± s）表示，各年齡組與3 種檢測(cè)方法結(jié)果比較用 Spearman檢驗(yàn)；各年齡組間確診病例的陽(yáng)性率比較用 2 檢驗(yàn)； 3

11、 種檢測(cè)方法陽(yáng)性結(jié)果與病程之間的比較用q 檢驗(yàn)7. 結(jié)果7.1 陽(yáng)性樣本經(jīng)過回顧性診斷，在配對(duì)研究組362 例研究對(duì)象中有152 例符合MP感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即有152 例確診病例，其中肺炎45 例，支氣管炎56 例，上呼吸感染49 例，支氣管哮喘2 例。MP快速培養(yǎng)法檢測(cè)出78 例陽(yáng)性，PCR法檢測(cè)出103 例陽(yáng)性，MP-Ab法檢測(cè)出127 例陽(yáng)性。7.2 結(jié)果分析各確診病例的年齡分布，見表 1 。 表 1 顯示兒童MP感染的年齡以3 4 歲年齡段的病例最多，為 46 例，陽(yáng)性率最高，為70.77%，與其余年齡組段比較P<0.05。 3 種檢測(cè)法的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果與年齡分布見表1 ，表 1

12、顯示 3 種檢測(cè)法與年齡之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以3 4 歲的年齡段與其余年齡組段比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。不同病程患兒3種檢測(cè)法的檢測(cè)結(jié)果，見表2，表2顯示MP快速培養(yǎng)法為陽(yáng)性的患兒病程均值較短為（ 4.5 ± 2.6） 天，PCR法為陽(yáng)性的患兒病程均值為（ 6.2± 3.5 ）天， MP-Ab 法為陽(yáng)性的患兒病程均值較長(zhǎng)為（8.1 ± 4.5）天。3 組之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.05） 。表 1 不同年齡組MP感染確診病例和3種檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比分析注：代表與年齡組3 4 歲組段比較結(jié)果表2 不同病程患兒3 種檢測(cè)方法陽(yáng)性結(jié)果

13、對(duì)比分析注：代表三組之間的兩兩比較8. 討論8.1 MP 感染的臨床表現(xiàn)常無特異性，臨床的實(shí)際工作中，容易與一般病毒性感冒相混淆 。在臨床上患兒有下列癥狀：（ 1）發(fā)熱呈弛張熱或不規(guī)則熱。刺激性咳嗽非膿性痰，偶帶血絲。 （ 2）可有咽痛、頭痛、胸痛，全身癥狀比體征明顯。（ 3）肺部體征不典型而胸片炎癥顯著，可見云霧狀大片陰影。（ 4） WBC正?；蛏摺＃?5）青霉素類、磺胺類抗生素治療無效，改用或一開始用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有效。（ 6）實(shí)驗(yàn)室MP檢驗(yàn)有1 項(xiàng)或 1 項(xiàng)以上陽(yáng)性具備以上2個(gè)條件或以上者可初步診斷為MP感染。多時(shí)候，臨床醫(yī)生為了盡快緩解患兒的癥狀，需根據(jù)患兒的癥狀、體征和病史做MP

14、感染的診斷性治療，但應(yīng)與肺結(jié)核相互鑒別。8.2 近年來由于診斷技術(shù)的提高，MP感染報(bào)道日漸增多，一般認(rèn)為MP感染以年長(zhǎng)兒發(fā)病較多，本文表 1 資料顯示，2 8 歲年齡段是發(fā)病的高峰期2 。占同期呼吸免疫科住院患兒的9.3%，比有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道各年齡組支原體肺炎占肺炎發(fā)病的10% 20%低。說明MP感染的發(fā)病年齡有提前，且年齡越小，臨床表現(xiàn)愈不典型。8.3 臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)MP的方法很多，過去所用的冷凝集試驗(yàn)法診斷MP感染缺乏特異性，敏感性也差，易受病程的影響3 。 本文采用配對(duì)資料研究，對(duì)疑為MP感染的患兒進(jìn)行3 種 MP檢測(cè)法，以探討MP快速培養(yǎng)法、PCR法和MP-Ab法等方法在兒童支原體肺炎診斷

15、治療過程中的敏感性。提示臨床醫(yī)生根據(jù)患兒不同的病程選取不同的檢測(cè)方法，以提高實(shí)驗(yàn)室的陽(yáng)性檢出率。8.4 .MP快速培養(yǎng)法是利用MP生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物使培養(yǎng)基液體中指示劑顏色發(fā)生改變來判斷 MP生長(zhǎng)；標(biāo)本中的其他支原體和細(xì)菌則因培養(yǎng)基中加入了青霉素和醋酸陀均被抑制。該法陽(yáng)性結(jié)果可48 h 檢出。結(jié)果顯示，培養(yǎng)法陽(yáng)性率為51.3%（ 78/152 ） ，低于另外兩種方法的陽(yáng)性率?？赡芘c在檢測(cè)前患兒已經(jīng)用了MP敏感藥物有關(guān)。表2 結(jié)果顯示，該法陽(yáng)性病例病程最短。提示病程時(shí)間較短的患兒選擇此方法對(duì)檢測(cè)的陽(yáng)性率較高。MP培養(yǎng)是診斷MP的金標(biāo)準(zhǔn)4 。8.5 . 咽拭子 PCR法檢測(cè)質(zhì)粒核酸，該法快速、敏感和特異

16、，通過一技術(shù)可從患兒痰中檢測(cè)MP-DN。A由于此方法相當(dāng)敏感，易受污染，故實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)應(yīng)特別小心。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，該法的陽(yáng)性率為67.76%（ 103/152 ） ， 高于快培法。此法彌補(bǔ)了極微量的和被藥物殺死的MP不能通過快速培養(yǎng)法檢出的病例。表2 結(jié)果顯示，該法陽(yáng)性病例，病程為（6.2 ± 3.5）天。詳細(xì)資料顯示，有病程在30 天以上的患兒經(jīng)抗MP治療，該法仍可為陽(yáng)性，說明MP的生存力相當(dāng)強(qiáng)，要系統(tǒng)化治療。血清 MP-Ab法陽(yáng)性率是3 種檢測(cè)方法中最高的，為83.55%（ 127/152 ） ，該法是檢測(cè)患兒血清中的MP抗體，而非直截了當(dāng)檢測(cè)MP本身，因而陽(yáng)性結(jié)果并不能確診是MP感染。對(duì)患兒狀態(tài)的綜合評(píng)估應(yīng)包括對(duì)患者臨床癥狀和試驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)分析。極低量的抗體可能不被此試驗(yàn)檢測(cè)出來。另外還有些MP感染的患者不產(chǎn)生抗體或只產(chǎn)生少量的抗體，高抗體滴度的樣品要出現(xiàn)前帶現(xiàn)象。表 2 結(jié)果顯示，該法陽(yáng)性病例，病程最長(zhǎng)，這是由于發(fā)病初期，機(jī)體中尚未產(chǎn)生抗體而不能被檢測(cè)出，提示發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)或經(jīng)過多種藥物治療過的患兒選擇此方法有較高的陽(yáng)性率。此檢測(cè)法結(jié)果往往受抗體出現(xiàn)的時(shí)相及患兒年齡、機(jī)體免疫系統(tǒng)狀況等多方面的影響。9. 結(jié)論臨床應(yīng)根據(jù)患兒的不同病程、不同年齡以及用藥情況來選取實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)方法，以提高M(jìn)P的陽(yáng)性檢測(cè)率，以更好地結(jié)合臨床癥狀進(jìn)行綜合分析，從而提高小