親和素和生物素系統(tǒng)

1、親和素和生物素系統(tǒng)第一頁，共14頁。親和細胞化學不同于免疫細胞化學，親和細胞化學是利用兩種物質之間的高度親和能力而相互結合的化學反應。目前，親和組織化學中的親和物質包括親和素與生物素、植物凝集素與糖類、葡萄球菌A 蛋白（SPA ）與IgG、抗原與抗體、陽離子與陰離子、激素與維生素和脂質與受體等。第二頁，共14頁。親和素和生物素系統(tǒng) 親和素和生物素系統(tǒng)是在免疫組織化學技術方法上不斷加以改進，與細胞生物化學緊密結合后的產(chǎn)物。 這種方法使免疫組化技術的敏感性得到進一步提高，更有利于微量抗原（或抗體）在細胞或亞細胞水平的定位，擴大了其應用范圍。第三頁，共14頁。生物素 生物素（biotin ），也稱維

2、生素H，是一種分子質量為244Da 的小分子維生素。 抗體分子經(jīng)生物素化后，其結合抗原的能力不受損失，細胞經(jīng)生物素化后仍能保持正常的分裂、增殖能力，因此被用作抗體、細胞的標記。 第四頁，共14頁。親和素 親和素（avidin）是一種分子質量為68000Da的一種堿性糖蛋白。親和素具有與其他示綜物質，如，熒光素、酶、膠體金等，結合的能力。 生物素和親和素之間有極強的親和力，比抗體對抗原的親和力要高出100 萬倍。 親和素有4 個亞單位，它具有4 個同生物素親和力極高的結合位點，因其能使生物素失活，故又稱抗生物素。第五頁，共14頁。鏈霉親和素 鏈霉親和素（streptavidin ）是一種從鏈霉菌

3、培養(yǎng)物中提取的蛋白質，相對分子質量60000，且不含糖鏈。 同親和素一樣，鏈霉親和素也具有4個生物素結合位點，親和力高達1015 mol/L，是一種更完美的生物素結合蛋白。因為它很少有低聚糖殘余成分，可保持中性等電點，避免了組織中的非特異性染色。 第六頁，共14頁。標記親和素-生物素法（labeled avidin biotin，LAB） 將親和素與標記酶（HRP）結合，一個親和素可結合多個HRP 將生物素與抗體（一抗或二抗）結合，一個抗體分子可連接多個生物素分子 細胞的抗原（或通過一抗）先與生物素化的抗體結合，繼而將酶標記親和素結合在抗體的生物素上，如此多層放大提高了檢測抗原的敏感性。第七頁

4、，共14頁。橋接親和素-生物素法（bridged avidin biotin，BAB） 先使抗原與生物素化的抗體結合，再以游離親和素為“橋”將生物素化抗體與酶標記生物素連接，也可達到多層放大效果。第八頁，共14頁。親和素-生物素-過氧化物酶復合物法（avidin biotin-peroxidase complex，ABC） 此方法為前兩種方法的改進，即先按一定比例將親和素與酶標生物素（或稱生物素化酶）結合，形成親和素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC 復合物）。第九頁，共14頁。 ABC 復合物不能飽和，即親和素上的4 個結合位點最多允許3 個位點與生物素化酶結合，留12 個位點與生物素化二抗

5、結合。 抗原先后與特異性一抗、生物素化二抗、ABC 復合物結合，最終形成巨大復合體，因該復合體網(wǎng)絡了大量酶分子，從而提高了檢測的靈敏度。第十頁，共14頁。標記鏈霉親和素-生物素法（Labelled streptavidin biotin ，LSAB） 它是采用生物素標記的第二抗體與結合有HRP 或AKP 酶的鏈霉親和素（streptavidin ）連接來測定細胞及組織中的抗原。第十一頁，共14頁。 鏈霉親和素同一定濃度的生物素化酶混合后，就能形成鏈霉親和素-生物素-酶復合物，這種復合物中至少存在1 個尚未被生物素占據(jù)的鏈霉親和素結合位點，可以和各種生物素標記抗體結合。由于采用了改良的親和純化技術和酶標技術，LSAB 法敏感性更高、背景更清晰。第十二頁，共14頁。LSAB法優(yōu)缺點 此方法與ABC 法相比，不需A、B 兩液提前混合，操作者容易掌握，穩(wěn)定性高，由于采用了低等電點的鏈霉親和素，其內源性生物素干擾要低于ABC 法。 該法生物素化二抗和鏈霉親和素HRP