Western Blot詳解

1、Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。本文主要通過以下幾個方面來詳細地介紹一下Western Blot技術:一、原理二、 分類i.放射自顯影ii.底物化學發(fā)光ECLiii.底物熒光ECFiv.底物DAB呈色三、 主要試劑四、 主要步驟五、 實驗常見的問題指南1.參考書推薦2.針對樣品的常見問題3.抗體4.濾紙、膠和膜的問題5.Marker的相關疑問6.染色的選擇7.參照的疑問8.緩沖液配方的常見問題9.條件的

2、摸索10.方法的介紹11.結果分析 一、 原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。 二、分類現(xiàn)常用的有底物化學發(fā)

3、光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。  三、主要試劑1、 丙烯酰胺和N，N-亞甲雙丙烯酰胺，應以溫熱(以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)儲于棕色瓶，4避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應是光催化或堿催

4、化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。3、 分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。4、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris

5、堿制備，再用HCL調節(jié)PH值，而不用Tris.CL。5、 TEMED原溶液N，N，NN四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.6、 SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍1.6ml，H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量1

6、00g。7、 Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。8、 轉移緩沖液：配制1L轉移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。9、 麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應予以廢棄。10、 脫脂奶粉5%(w/v)。11、 NaN3

7、0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。12、 Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、 過氧化物酶標記的第二抗體。15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。18、 100mmol/L NaCl。19、 

8、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。（可以參看分子克隆） 四、主要步驟生物秀為您搜集了現(xiàn)階段幾乎網(wǎng)上所有的Western Blot的中英文資料，僅供實驗參考，可以根據(jù)自己實驗的實際情況進行調整：Western Blot PROTOCOL： 五、 實驗常見的問題指南根據(jù)問題的類型主要分成以下幾類（以下資料權作參考，請勿盲目模仿！）： 1. 參考書推薦 A. 對初學者看什么資料比較好？解答：抗體技術實驗指南和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane

9、）兩本書不錯。 2. 針對樣品的常見問題 B. 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot （以下簡寫成Western Blot），提取線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120g，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？解答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗?jié)舛取τ诩拥鞍酌敢种苿﹣碚f，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。E. 同一蛋白樣

10、品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？解答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。 F. 如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。G. 我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉到了膜上，就是在轉膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？解答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉移時你可以用減少電流延長時間，多加510甲醇。 H. 想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-

11、PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？解答：260kd的蛋白不好做， 分離膠用6， Stacking Gel 3.5。 I. 如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚。解答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的 comb。 J. 蛋白變性后可以存放多久？解答：80，一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不

12、要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。 K. 我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應當采用7.5%，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11的配方，不知為何？解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用，因為105的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內，但需注意條帶位置。 L. 接下來我準備采用DAB顯色技術，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調整，能否再用5的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？ 解答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用代替應該好一點 M. 還有一問題，一般一

13、次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關系嗎？解答：Western Blot一般上樣30100微克不等，結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時間都有關系，也與顯色時間長短有關。開始摸條件時，為了拿到陽性結果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當然背景也就出來了。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結果不容易。 . 做組織樣品的western的時候，處理樣品有什么訣竅嗎？還有，您用過大牛血清做封閉劑嗎？濃度如何？效果是不是比BSA好一點？解答：必須進行研磨、勻漿、超聲處理

14、，蛋白質溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入和蛋白酶抑制劑cocktail），封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用。如果一抗為多克隆抗體，使用也是不錯的選擇。 O. 您是否可以介紹一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？解答：做200kd蛋白的Western Blot時要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時要小心；轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。 P. 有什么方法可以提高上樣量？解答：

15、可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量。 Q. 我要檢測的目的蛋白是分子量大概為42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速離心機，有沒有直接用低溫高速離心機就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞漿蛋白，用這個做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速離心機。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的轉移方法實施。 R. 蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？解答：上樣量要根據(jù)實驗的要求來定， 如果要求是定量和半定量的W

16、estern Blot 則上樣量要均等， 如果只是要定性，則沒有太大的關系， 盡量多上就行了， 但是不要超過0.3g/mm2。S. 一抗，二抗的比例是否重要？解答：比較重要，調整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。 3. 抗體 T. 做細胞信號傳導，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？解答：對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。 U. 同一公司的另外抗體用這個稀釋度做出來效果很好，所以沒做預試，怕費時間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ELL+plus試劑盒顯色。轉膜

17、過夜，一抗孵育也是過夜的，若封閉也過夜的話就要四天才看的到結果了。解答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其最佳的抗體稀釋度也是不一樣的，需要你實驗摸索。我覺得轉膜過夜好像沒有必要吧，轉膜的目的也就是將蛋白轉到膜上就行啦，何必浪費時間呢。至于具體的轉膜時間，還要看你的目的蛋白分子量的大??；轉膜的設備，是半干式，還是濕式。一抗當然可以過夜，如果你想所短Western Blot時間的話，可以增高一抗的孵育溫度，我們實驗室一般37度，兩小時就足夠了；你可以參照抗體說明書。至于一抗和二抗得稀釋度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000試試。另外建議你洗膜時，多洗幾次，最好是在封閉；一抗和二抗后至少是

18、5x5min，跑一張好膜不容易，多盡點心吧，這樣不會浪費你的時間，只會節(jié)省你的時間！ V. 免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？解答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗） W. 

19、;Western Blot 中抗體的重復應用問題解答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用23次。稀釋后應在23天內使用，4度保存，避免反復凍融。 4. 濾紙、膠和膜的問題 X. NC膜 PVDF膜 尼龍膜怎樣鑒別？解答：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應用最廣的一種固相支持物，價格最便宜；PVDF膜介于二者之間。就結合能力而言：尼龍膜結合DNA和RNA能力可達480600g/cm2，可結合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結合DNA和RNA能力可達80100g/cm2，對于200bp的核酸片段結合能力不強；PV

20、DF膜結合DNA和RNA能力可達125300g/cm2。就溫度適應性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結合DNA，結合不牢固；PVDF膜結合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強。就重復性而言：尼龍膜可反復用于分子雜交，雜交后，探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重復使用；PVDF膜可以重復使用。 Y. 在做Western Blot時，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負

21、電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。 Z. 檢測磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎？解答：可以。 AA. 轉膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端（即點樣空的一側）的轉膜好象不是很好，為什么？解答：這是正常的，大分子的蛋白轉移的慢， 你延長轉移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。 BB. 我想問您裂解細胞用三去污裂解法，還是用上樣緩沖液？解答：用上樣緩沖液，這樣有幾個好處，可以提取總蛋白，同時又可以讓磷酸化酶失活。 CC. 采用tank system有什么講究？解答：建議

22、低電壓，長時間，（一般tank System 用衡壓好點），如 28V 1416hrs。 DD. 做HSP WESTEN定量，同樣的抗體免疫組化能做出，而WESTEN卻不能？解答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做Western Blot和IHC。 EE. 膜一般要如何處理？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。 FF. 如果是6×8轉印膜，要加多少一抗？解答：一抗的稀釋度是有說明的，根據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為35ml。GG. 上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果。解答：無要求。 HH. 跑電泳

23、的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？解答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了。如果過夜，膠里的水分被蒸發(fā)，采用保鮮膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑，避免找問題麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會造成膠縮。 II. 膜、濾紙、膠大小有何講究？解答：如果是用的是半干轉，順序為：陰極濾紙膠膜濾紙。濾紙的長寬分別比膠小12mm，而膜的長寬分別比膠大12mm。絕對禁忌：上下兩層濾紙因為過大而相互接觸，這樣會短路，電流不會通過膠和濾紙。

24、JJ. 蛋白質的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？解答：這么廣的分布不好轉移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉，12SDS-PAge， 濕轉36V ， 35hrs就可以了， 可以根據(jù)你實驗室的經(jīng)驗調節(jié)；170kd 用7%SDSpage， 48V 10hrs16hrs。 KK. 不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上， 轉移效率低怎么樣解決？解答：可以考慮：轉移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉移緩沖液，可以參考蛋白質技術手冊)，因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率，但可增加蛋白質和NC膜的結

25、合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉移效率；用優(yōu)質的轉移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉移電壓電流；增加轉移時間。 LL. 如何選擇最合適的蛋白雜交膜？解答：蛋白質印跡雜交是分子生物學實驗中極為常用的一門技術。選擇質量上層、合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項實驗成敗的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)雜交方案、被轉移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我們要量體裁衣，從雜交膜的材質、孔徑和規(guī)格上都要做出合理的選擇。硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜是蛋

26、白印跡實驗的標準固相支持物。在低離子轉移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負電荷的蛋白質會與硝酸纖維素膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結合在一起，雖然這其中的機制還不是十分清楚，但由于硝酸纖維素膜的這個特性，而且易于封閉非特異性結合，從而得到了廣泛的應用。在非離子型的去污劑作用下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。但是膜孔徑如果小于0.1mm，蛋白的轉移就很難進行了。因此，我們通常用0.45m和0.2m兩種規(guī)格的硝酸纖維素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2m的

27、膜了，如果用0.45m的膜就會發(fā)生“Blowthrogh”的現(xiàn)象。從膜的質地上來看，最重要的指標就是單位面積上能夠結合的蛋白的量。硝酸纖維素膜的結合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關，市場上有些硝酸纖維素膜通常會還有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結合量。S&S公司采用的是100%純度的硝酸纖維素，保證了最大的蛋白結合量，可達80-150g/cm2。由于100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結合，降低雜交背景，無需高嚴謹度的洗脫步驟。其次，膜的強度和韌性也是需要考慮的因素。常規(guī)的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會破損，不能反復使用。PVDF轉移膜：PVDF是一種高強度、耐腐蝕的物

28、質，通常是用來制造水管的。PVDF膜可以結合蛋白質，而且可以分離小片段的蛋白質，最初是將它用于蛋白質的序列測定，因為硝酸纖維素膜在Edman試劑中會降解，所以就尋找了PDVF作為替代品，雖然PDVF膜結合蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由于它的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜與硝酸纖維素膜一樣，可以進行各種染色和化學發(fā)光檢測，也有很廣的適用范圍。這種PVDF膜，靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細工藝下比常規(guī)的膜都要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進行浸泡飽和1-5秒鐘。離子交換型轉移膜：硝酸纖維素和PVDF膜是靠疏水作用結合蛋白

29、的，還有一類膜是根據(jù)離子交換的方式結合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修飾的纖維素制成的DEAE陰離子交換膜同樣可以 作為蛋白質印跡的固相支持物。DEAE可以有效的結合陰離子基團，包括那些高于其等電點的蛋白質。在pH10以下，DEAE基團都能帶電荷，在低離子強度的轉移液中結合蛋白分子。其最適的pH環(huán)境為5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血紅蛋白的研究。這種0.45m孔徑的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，還可以用于核酸結合研究。還有一種離子交換型膜是羧甲基（CM）修飾的纖維素膜，它可以結合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，最適結

30、合pH范圍在4-7。結合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來，用于氨基酸系列分析或微測序。 5. Marker的相關疑問 MM. 我用的是可視marker（BIO_RAD），但是電泳總跑不全8條帶，請問什么原因？怎樣改善？膠用過8，10，12，都是這樣。marker是新買的。解答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。 NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western Blot時還

31、能夠看到marker，當然也僅能看見其中最多三條帶。用80V進行SDS-PAGE電泳，用恒壓10V45min轉印的。前幾次做Western Blot時沒有進行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現(xiàn)。再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養(yǎng)基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體（Anti-V5-HRP）。但就是出不來結果，我很茫然。謝謝您過給予指點！ 解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10k

32、d組成的marker。開始做Western Blot時還能夠看到marker，當然也僅能看見其中最多三條帶?！庇械臅r候，Prestained Marker 放久了效果就會變差，電泳是條帶不清晰，擴散。但是你的問題可能還有其他的方面的問題，可能是蛋白跟膜結合的不緊密。轉移是多加點甲醇。2、“前幾次做Western Blot時沒有進行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現(xiàn)?！鞭D移時半干法建議用恒流，你這樣的也就30kd-50kd的轉移地比較好。3、“再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養(yǎng)基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接

33、用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體（Anti-V5-HRP）。”是否檢測了表達量，二抗是否是好的，你做了陽性對照？你要做這么大的蛋白最好轉移時間延長到1.5hrs。 6. 染色的選擇 OO. Western Blot哪種染色好？解答：（1）陰離子染料是最常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達到1.5g，考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質中除去 ，以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。（2）膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg

34、級，但染色比穩(wěn)定。（3）生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。 7. 參照的疑問 PP. 是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內參？解答：對于發(fā)表文章的實驗最好加內參，實驗嚴謹。 QQ. 用BANDSCAN分析結果行嗎？解答：分析一般的結果沒問題。 RR. 核內抗原Western Blot內參選擇什么合適？解答：可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中的表達是很穩(wěn)定的，有很多都可以當成內參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內參。 SS. 轉膜時采用電流是否比電壓準確，是否根據(jù)0.8mA/cm2，一般1小時左右？解答：不是的，&#

35、160;半干法推薦用恒流，一般根據(jù)目的蛋白的大小來確定電流和時間。 TT. 做半定量人卵巢癌細胞系的Western Blot，內參B-actin，GAPDH，那個好？解答：選用beta-actin就可以。 8. 緩沖液配方的常見問題 UU. 轉膜后的脫脂奶粉封閉時，所用的防沫劑A是什么？還有Tris-HCl是不是就是用Tris和鹽酸配出來的呢？解答：轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉。TrisHCl就是Tris鹽用HCl調ph值，配置而成。 VV. 準備做大鼠腦子的Western Blot，蛋白質位于細胞核中，請問此蛋白質的提取液及操作方法是

36、？每一步都必須要低溫嗎？這種蛋白質是磷酸化的蛋白質，操作時如何防止去磷酸化的發(fā)生？解答：可以用提取總蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。 WW. 想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？解答：一般來說提取時加入光譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。 XX. 最近作了兩次Western Blot，不但沒陽性結果，顯色背景都沒有，電泳和轉膜都染過，有條帶。底片和顯色液及DAB顯色液均試過，沒問題。1、檢測GAD-分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去

37、污裂解液。蔗糖不會有影響把？樣本-20度放置一周內測。2、一抗放置2年，可能效價不高！用的是 1:100。如果是一抗的原因，不會背景都沒有把？3、第一次有不均勻背景，因為一抗過夜時密封袋不均勻。后兩次無背景顯色。4、封閉液用的是含15%脫脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20為 0.1%，不會是封閉液的問題吧？解答：可以在下面幾個問題上找找原因。1. 封閉液用5Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有問題。 YY. 加甲醇的目的是什么？解答：加甲醇起著一定的固定作用，因

38、為小分子蛋白質容易轉出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因為NC膜結合蛋白質的能力較弱)。 ZZ. “轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBST最后那個T是Tween嗎，濃度多大？解答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add dis

39、tilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving. AAA. 封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如現(xiàn)在我就在室溫里做，或者要在4度下?解答：均可在室溫進行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時，然后4度過夜。 BBB. 實驗室暫無NP40我用sds可以嗎？另外有過用尿素和硫脲提取膜蛋白嗎？配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，新鮮加入：65mM DTT蛋白酶抑制劑：試劑盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)是用

40、于抽提雙向電泳用蛋白的配方。不止用于抽提細胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？改良的RIPA裂解緩沖液(Tris.HCl， 50 mmol/L， pH 7.5; NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%; 脫氧膽酸鈉， 0.5%; SDS， 0.1%; EDTA， 1 mmol/L; PMSF， 1 mmol/L; Leupeptin， 2 g/ml)不知對于膜蛋白效果如何？此外該方中的EDTA， 是否用做蛋白酶抑制劑？解答：做絕對不推薦使用（因為即使進口的也不純，其中的雜質會影響質譜結果）。對于動物細胞，其蛋白酶活性較弱（相對于組織和大腸桿菌等），可以不使用c

41、ocktail，因為7M尿素硫脲構成的變性環(huán)境已經(jīng)足以抑制大部分蛋白酶的活性，硫脲對于抽提膜蛋白有很大的幫助，不過如果您專職做膜蛋白建議采用分級抽提法。此外還可以采用梯度離心法和一些基于去垢劑的方法。用于滅活金屬蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加過多的蛋白酶抑制劑可以導致蛋白質的修飾，做無所謂，做時會給正確鑒定帶來麻煩。裂解緩沖液中少了兩性電解質(在2-D裂解緩沖液中，兩性電解質起的作用：提供連續(xù)的PH梯度，從很大程度上增加蛋白質的溶解性;還可以去除一部分核酸)；也不推薦采用SDS，因SDS會與蛋白質結合導致其等電點發(fā)生改變，如果您實在要用，終濃度降到0.1%以下。 METHOD2（50ml總量）

42、：?-mercaptoethanol 342 l；20% SDS 5 ml；Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至 50 ml。方法：將用過的膜浸入stripping buffer中，置50水浴箱中30min，間斷振搖。之后用TTBS洗3*5min就好。此時你已經(jīng)可以按新的轉移好的膜來再次使用了。該方法的優(yōu)點：省事，省力，省錢，符合國際慣例。 METHOD31、beta-metaptoethanol 35ul 2、10%SDS 1ml 3、tris (0.5M，pH6.7) 625ul 4、dH2O 3.34ml 50-55，30min。 METHO

43、D4stripping buffer應該是可以放置很久的。不過我習慣于現(xiàn)配畢竟，加了-mercaptoethanol 以后太難聞了，配了就用；而且，有了現(xiàn)成的Tris-HCl緩沖液和SDS的母液，現(xiàn)配還是很方便的。每次用量5ml少了點，我每次用50ml。 METHOD50.5M NaCl，0.5M HAc；室溫搖床15min。 METHOD6將用過的膜泡在1*TBS中室溫振搖過夜，中間可以換液2-3次，然后封閉，加一抗，二抗（同第一次發(fā)光），實踐證明方法完全可行。 不管用那種方法，洗脫后都要用PBS或TBS再洗幾次。 9. 條件的摸索 DDD. 用的是Santa Cruz的

44、抗體，也實驗過一抗和二抗肯定能結合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍染色沒問題，但是不知道與Marker對應的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時轉膜后，麗春紅染色發(fā)現(xiàn)大分子量蛋白轉過去的較少。難道是裂解液出了問題？我用的是三去污劑，但沒加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解 -80度凍存的細胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克?。ǖ诙妫┥系募訕觔uffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。不知道是哪里出了問題？解答：建議：1、首先確定您提的蛋白質量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測蛋白的濃度，一般來講，其

45、濃度應該在幾-20微克/微升。2、若是蛋白沒問題，哪就看是不是電泳的問題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10和12的膠。60-80V，1小時左右。跑過積層膠與分離膠的線時，換用100V，3-4小時。3、轉膜，建議恒壓，15V，不用轉2小時，45分鐘足以。您所說的大蛋白轉過去的，并不是真正的少，而是因為在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾經(jīng)也轉過2小時，但和45分鐘的區(qū)別并不大。4、根據(jù)MARKER的條帶（我的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據(jù)MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）

46、的條帶。這樣第一，可以節(jié)省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。5、延長1抗、2抗孵育時間（我曾室溫1小時，4度過夜），適當加大1抗?jié)舛取?、我買的也是Santa Cruz的抗體，我覺得質量還可以，我想您應該先找其他方面的原因。 EEE. 電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細胞和一抗在我的整個反應體系下做出來了，當然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題應該出在抗原和一抗上，不知對不對。解答：電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即可。正常條件下，電泳時溴酚藍和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以決定

47、電泳的電壓和時間。建議你用恒壓80100伏。 FFF. BIO-RAD的半干轉運系統(tǒng)有一個很致命的弱點就是無法控溫（我用的就是這種），當電流過高，而系統(tǒng)的散熱又比較差，濾紙的吸水性比較差的情況下，就很容易燒膠。就轉膜時，是采取恒壓還是恒流的問題，我想和大家探討一下，我感覺我這個系統(tǒng)用恒流很容易燒膠，我的膠有68cm2，用50mA恒流來轉膜，剛開始電壓就很高，有20 v左右，而用恒壓，開始電流有110mA，但15min后，電流就降到8OmA，30min后就穩(wěn)定在40mA，不就相當于恒流嗎？解答：恒流時電壓逐漸升高的原因是濕濾紙逐漸變干因而電阻逐漸增大的緣故，如果電壓升得太快，可以使濾紙

48、更濕一些以克服。就我的感覺，20V的電流30min以后20Kd以下的分子丟失很多，不過我用的是小膠40cm2，不知有無不同。 GGG. 我想盡量提高轉膜的效率（我的實驗要求轉到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？解答：不管怎么轉都會存在蛋白轉移不完全（電壓過小時間過短）或過度轉移（電壓過大時間過長）的問題，魚（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進行轉膜，下半時間短，上半時間長一點，應該會好一些。 HHH. 請問一下PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？解答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用

49、來和蛋白質相聯(lián)，這樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。 III. 1、煮好后的樣品，若沒有及時上樣分離，應如何保存，可以保存多久？2、有沒有人在用bio-rad的小型垂直電泳槽，有沒有操作手冊？3、濕式轉移時是否必須要用bio-rad的專用濾紙？4、恒壓轉移的條件如何確定，因為我要分離小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白質，轉移條件能夠相同嗎？5、凝膠的濃度是不是可以用一個濃度？書上寫不同的凝膠濃

50、度分離的分子量范圍不同，還給出了一個線形范圍，是不是不在這個范圍內也能分離，只是就不是線性范圍了？解答：1、煮好后的樣品，放到-20，我們在一個月后此樣品，效果一樣。2、bio-rad的小型垂直電泳槽的操作手冊在他們的主頁Bio-Rad USA上有。3、轉移時一般的WATERMEN濾紙就可以。4、轉移條件是和蛋白質大小有關的：以次確定電壓和時間。具體可讓ptglab幫你定奪。5、凝膠的濃度也是和分離蛋白質大小有關。不是隨心所欲選的，否則分離效果可能不是你所期望的。 JJJ. 怎樣設計實驗來確定最佳的條件？解答：隨便說一點， 具體的還是需要自己想：1、在每個上樣孔里上同樣的蛋

51、白樣品，量也一樣，最好是組織樣，（也可以跑1 個大 well， 不插梳子，多上樣，）SDS-page；2、轉移， 設定電流或電壓；3、每隔 1（or n） 小時，取一點膜染色，看轉移效果。 KKK. 我要測兩種抗體，一種為磷酸化的目的蛋白，一種為總的目的蛋白，不知道用什么方法strip最好，我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分鐘，似乎沒什么效果？解答：你可以加巰基乙醇（loading buffer 一樣的濃度），56度， 30mins，看看。 LLL. 1、在用PBS洗滌抗原-抗體-ProteinA-Agarose復合物時，每次要重懸多長時間合適

52、？2、最后用2xSDS重懸抗原-抗體復合物離心后，由于2XSDS中已經(jīng)加入了溴芬蘭，因此下面的Agarose珠子幾乎看不到，所以吸取上清加樣時也不知道里面是否吸進了Agarose。不知有什么方法可以解決這個問題，或者即使吸進了一些Agarose也不要緊呢？解答：1、不用重懸多久，重懸起來了就可以離心了。2、加2X BUFFER前大體上已經(jīng)知道有多少膠粒了，吸到那個位置時小心點就是了。我也試過一些次，首先離心稍微長一點，長20秒吧，希望膠粒能沉得結實點（我想象的），再吸取。如果感覺槍頭不是很順暢的時候可能就是碰到膠粒了。很難一點膠粒也吸取不上來的，盡力做好就是了。 MMM. 磷酸化抗體

53、的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？解答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。我做的時候從未加過，都做出來了。 NNN. Western Blot中block的最短時間?解答：每一步1小時足夠了， 中間換抗體要洗的話多換液幾次，每次時間10分鐘就夠，洗3次只要半小時。跑膠1小時， 轉移1小時，block半小時就行，1抗1小時，洗半小時，2抗1小時，洗半小時，顯色10分鐘。一般跑兩塊膠，一塊染色， 一塊western。一天肯定完事，一般不用等到第二天。 OOO. 想用Western檢測基因轉染后細

54、胞培養(yǎng)上清中表達的目的蛋白（定性），分子量為20KD，濃度約為幾百ng/ml。蛋白樣品需濃縮、純化嗎？如何濃縮、純化上清液中的目的蛋白？對小分子蛋白Western blot時需特別注意哪些條件？解答：按照你提供的濃度，如果做Western Blot，是不用濃縮樣品的. 對于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：1、轉移時的時間，2、轉移時的電流或電壓.3、transfer buffer 中加20%的甲醇.4、可以用13-15%的分離膠. PPP. 蛋白分子量大小分別為21kd、28kd，用的是濕轉，請問多大電流，多長時間比較合適？解答：分子量比較小，最好是用干

55、轉，濕轉效率太高，易轉過了。干轉的話，用2.5 A/cm2， 30min就應該夠了。濕轉，按照bio-rad的說明，用100mA，也得要半個多小時吧。 QQQ. 需要測同一種蛋白質的總量與磷酸化的量，但相互間干擾太大，怎么辦？解答：將膜放入stripping buffer（SDS 2%，Tris·Cl (PH=6.7) 62.5mM，beta-巰基乙醇 100mM）中，50孵育30分鐘，TTBS西三次，再重新加入一抗，進行另一種抗原的檢測。 RRR. 做Western Blot實驗時，發(fā)現(xiàn)轉膜時的電流總是偏小，轉膜的效率也偏低. 100V恒壓轉膜時的電流只有190

56、mA左右，而以前都有250mA。體系和條件都和以前一樣，只是環(huán)境溫度比以前低了很多。解答：有可能重復使用了轉移緩沖液，隨著離子的逐漸減少，電阻越來越大，當然恒壓時電流越來越小了。建議更換轉移緩沖液。反復使用不要超過三次。環(huán)境溫度低是有利于轉移的。 SSS. 我電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細胞和一抗在我的整個反應體系下做出來了，當然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題應該出在抗原和一抗上，不知對不對。一抗我買的是單抗，推薦的稀釋度是1：1001：1000。我用的是1：100。難道非要用多抗嗎？按道理單抗也應該出條帶呀

57、！細胞用三去污劑裂解的，沒有做定量，加巰基乙醇變性后，每孔上樣20微升。提出的蛋白我保存在4度了，這樣行嗎？解答：1、建議您用恒壓進行電泳，先用70V，等跑過積層膠與分離膠的界限時，換用90-100V，再跑3小時左右。2、轉膜可用恒流，但要根據(jù)你的膜的面積及所要檢測的蛋白的分子量的大小來確定電流的大小，一般來講，分子量大的蛋白就用的電流大些，譬如，你膜的面積是30CM2，蛋白的分子量是80KD，那么你就可以以2.0mA/CM2的條件進行，你就可以60mA的電流進行。3、我覺得你的抗體應該沒問題。4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我們實驗事都是保存在-20度的，提出蛋白分裝保存在-20度。 TT

58、T. 目的蛋白是一種6KD的分泌性蛋白，RTPCR就顯示細胞中mRNA表達不高，估計將培養(yǎng)上清凍干濃縮后采用Western Blot還可能檢測不出，但如果用western，是否一定要用0.2m的膜？用Tris-tricine SDSPAGE電泳，電泳時分別管制三層凝膠，分離膠用40T丙稀酰胺（2.6C）濃度為16.5，另外兩層都用30丙稀酰胺，中間一層濃度為10，積層膠濃度為4，凝膠厚度1mm，轉膜的條件試過30V70分鐘，膜上可見到小分子蛋白marker的條帶，似乎見到目的條帶，上樣量為60g細胞胞漿總蛋白，轉膜的條件怎么樣合適？解答：一定要用0.2m的膜，并且轉移的條件要摸索一下

59、，小分子的Western不好做，要根據(jù)你的實驗器材來定，一般你要是有prestained marker就可以參照一下，如果相應的分子量大小的marker轉移的好就可以了。 UUU. 怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上樣的量很重要，罐膠有什么技巧嗎？想跑漂亮，是不是應該先小電壓，再高電壓，總體上電壓小些會跑的好些?還有前面有人說電泳液平玻璃板會使電泳條帶漂亮些?解答：影響跑膠跑的質量，有以下幾個因素：1、電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑得很好。2、膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒

60、膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠，使膠不均勻。 VVV. 為什么提高大分子量蛋白的轉移的時候，小分子量蛋白會丟失一些哪?什么原因?解答：小分子的蛋白在轉移過程中，會透過膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過去了。 WWW. 上次轉染了1.6*106細胞，收集，收集到了400微升體積，加6*loading buffer， 95度煮5分鐘，-20度，交替3次，離心，上樣，7%分離膠，先80v跑進分離膠，在100v電泳至溴酚蘭出膠，biorad半干轉PDVF膜，15v轉30分鐘，預染marker全部進膜，轉移后的膠考馬斯亮蘭染，可見殘留的蛋白帶，大分