微生物化驗員應(yīng)知應(yīng)會學(xué)習(xí)資料

1、【精品文檔】如有侵權(quán)，請聯(lián)系網(wǎng)站刪除，僅供學(xué)習(xí)與交流微生物化驗員應(yīng)知應(yīng)會學(xué)習(xí)資料.精品文檔.2012年應(yīng)知應(yīng)會學(xué)習(xí)資料微生物化驗員二一二年十月目 錄一、檢測控制2二、食品安全風(fēng)險監(jiān)測3三、精密儀器管理3四、在線實驗室管理5五、實驗室安全及防護(hù)知識5六、微生物基本知識6七、微生物檢驗基本手段和準(zhǔn)備工作6八、微生物檢樣的采集7九、食品微生物學(xué)常規(guī)檢驗技術(shù)8十、無菌間、實驗室生物安全防護(hù)規(guī)則12一、 檢測控制1、 原輔物料和產(chǎn)品需按照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和研究院下發(fā)的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)實施檢驗，分公司因儀器配置不足原因不具備檢測能力的項目需委托片區(qū)或質(zhì)監(jiān)部檢測；2、 原料包材進(jìn)貨驗收應(yīng)錄入原輔包材進(jìn)廠驗收自動化信息系

2、統(tǒng)（IQC系統(tǒng)）；成品報告單應(yīng)及時錄入成品報告單系統(tǒng)3、 不符合質(zhì)量要求的原料，指不在標(biāo)準(zhǔn)明確的合格或受限使用范圍、在標(biāo)準(zhǔn)中未規(guī)定可以調(diào)整等級的不合格原料，一律按不合格判定，不符質(zhì)量要求的原輔材料倉庫不入庫、車間不領(lǐng)用；不合格產(chǎn)品不得發(fā)貨。二、 食品安全風(fēng)險監(jiān)測宗總提出“構(gòu)建企業(yè)自主食品安全風(fēng)險監(jiān)測和預(yù)警體系”1、 意義：保障食品安全是國際社會面臨的共同挑戰(zhàn)和責(zé)任。構(gòu)建企業(yè)自主食品安全風(fēng)險監(jiān)測和預(yù)警體系，有利于早發(fā)現(xiàn)、早報告、早處置食品安全風(fēng)險，積累食品安全管理經(jīng)驗，為食品安全風(fēng)險評估和預(yù)警提供科學(xué)數(shù)據(jù)和實踐經(jīng)驗，確保食品安全。 2、 目前的工作方向：每季制定各類產(chǎn)品和原料的食品安全風(fēng)險監(jiān)測計

3、劃，通過市場抽樣、分公司抽樣、產(chǎn)品和原料留樣檢測，組織集團(tuán)、片區(qū)、分公司檢測人員實施三聚氰胺、黃曲霉毒素、鉻等三十多項指標(biāo)的風(fēng)險檢測，發(fā)現(xiàn)問題，及時預(yù)警。 3、 國內(nèi)發(fā)生的食品安全事件1) 三聚氰胺事件：目前液態(tài)奶及奶粉的三聚氰胺限量值是（2.5mg/kg）2) 皮革奶事件：目前主要通過檢測L-羥脯氨酸來判定。3) 黃曲霉毒素事件：乳及乳制品、嬰幼兒配方食品的黃曲霉毒素M1的限量均為0.5g/kg.4) 毒膠囊事件：毒膠囊事件是制造過程中加入了（工業(yè)明膠）使得重金屬（鉻）超標(biāo)。5) 伊利“汞”超標(biāo)事件 三、 精密儀器管理宗總指出：“化驗室管理需要加強(qiáng)，特別需做好高價值檢驗儀器的使用管理，提高操

4、作保養(yǎng)規(guī)范性，有效地提高公司質(zhì)量監(jiān)控水平。”(一) 儀器設(shè)備的使用維護(hù)1) 實驗室指定專人為儀器設(shè)備管理員，統(tǒng)一負(fù)責(zé)實驗室儀器的維護(hù)和管理，每臺儀器設(shè)備應(yīng)有具體保管人。2) 主要儀器設(shè)備應(yīng)制定操作作業(yè)指導(dǎo)書，內(nèi)容應(yīng)包括：正確的操作順序和方法，安全注意事項，維護(hù)保養(yǎng)方法。主要儀器包括乳成分分析儀、凱氏定氮儀、液相色譜儀、原子吸收光譜儀、原子熒光光度計、分光光度計、糖度儀、旋光儀、Hach濁度儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、實驗室均質(zhì)機(jī)、高速離心機(jī)等。）3) 儀器作業(yè)指導(dǎo)書和使用記錄本應(yīng)放在指定位置，便于使用和檢查。4) 儀器設(shè)備使用者必須熟悉儀器設(shè)備的性能、操作規(guī)程以及維護(hù)保養(yǎng)辦法。未獲得上崗操作資格的人員不得

5、擅自使用。5) 儀器設(shè)備使用者應(yīng)自覺愛護(hù)儀器設(shè)備，經(jīng)常保持其整齊清潔。嚴(yán)格按作業(yè)指導(dǎo)書使用及維護(hù)儀器設(shè)備，填寫儀器使用記錄。6) 儀器使用前或使用過程中出現(xiàn)故障或顯示結(jié)果可疑或檢定證明其有缺陷時，應(yīng)立即停止使用，加貼停用標(biāo)識，故障儀器不得在實驗中使用。7) 儀器設(shè)備需備有3個月耗材，以確保檢測工作正常開展。(二) 精密儀器的使用維護(hù)需重點關(guān)注的精密儀器主要包括：1、 大型精密儀器，包括凱氏定氮儀、乳成分分析儀、液相色譜儀、原子吸收光譜儀、原子熒光光度計、氣相色譜等；2、 實驗室常用精密儀器，包括糖度計、分光光度計、pH計、旋光儀、Hach濁度儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、實驗室均質(zhì)機(jī)、高速離心機(jī)、耐破儀、邊

6、壓儀、涂膜厚度測定儀等。1.凱氏定氮儀：1）儀器（含消化爐）整體清潔，儀器外部及內(nèi)腔無堿液殘留；試劑桶清潔；2）消化管無缺口或裂縫；3）消化管橫梁無破損或缺口，密封圈未老化；4）堿桶內(nèi)無沉淀和絮狀物；5）消化系統(tǒng)必須接尾氣排放水抽泵；6）每周做一次蒸餾系統(tǒng)驗證，每兩周做一次全系統(tǒng)驗證，回收率在99.0%-101.0%。2.乳成分分析儀：1）儀器整體清潔，儀器外部、內(nèi)部腔體、管路無殘留奶垢，均質(zhì)器不漏液；2）每周對乳成分分析儀進(jìn)行浸泡流管及硬件強(qiáng)力清洗，并在使用記錄中記錄強(qiáng)力清洗信息；3）每周三次對含乳產(chǎn)品進(jìn)行蛋白含量單項比對校準(zhǔn)并做好記錄；4）產(chǎn)品模塊定標(biāo)樣品數(shù)量應(yīng)大于8個，且定標(biāo)濃度范圍需覆

7、蓋可能涉及到的樣品含量。3.液相色譜儀：1）儀器整體清潔，儀器外部、內(nèi)部無積灰；2）標(biāo)準(zhǔn)品、備件、耗材需配備齊全，至少需備有三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，備有1根全新C18 長度150mm 色譜柱、1盒全新C18保護(hù)柱，安捷倫液相需備有色譜純（HPLC級）異丙醇試劑；3）水相排氣，安捷倫液相過濾白頭壓力不超過10bar，Waters液相在線濾芯壓力不超過300psi。4.原子吸收光譜儀：1）儀器整體清潔，無積灰；2）實驗用硝酸和高氯酸必須為優(yōu)級純，且有驗收記錄，驗收標(biāo)準(zhǔn)為鉻試劑空白2g/L，鉛試劑空白3g/L；3）氬氣純度至少為99.99%；4）至少備有鉛、鉻標(biāo)準(zhǔn)品并有標(biāo)準(zhǔn)品證書；5）儀器至少每半月開機(jī)一次

8、。5.原子熒光光度計：1）儀器整體清潔，無積灰；2）氬氣純度至少為99.99%；3）至少備有砷、汞標(biāo)準(zhǔn)品并有標(biāo)準(zhǔn)品證書；4）儀器至少每半月開機(jī)一次。6.糖度計：1）要求防潮防塵，RFM340糖度計的吸水硅膠應(yīng)保持蘭色；2）ATAGO糖度計后部的過濾網(wǎng)應(yīng)定期清潔；3）棱鏡金屬面應(yīng)無劃痕。7.分光光度計：1）樣品室內(nèi)應(yīng)無積存的溢出溶液；2）光路及元件無明顯腐蝕；3）不使用時樣品室內(nèi)應(yīng)無樣品；4）無樣品時樣品室蓋應(yīng)保持關(guān)閉；8.pH計：1）pH計顯示數(shù)值應(yīng)穩(wěn)定，不能有大幅跳動情況；2）按鍵和旋鈕使用正常；3）電極保持潔凈，復(fù)合電極的外參比液為3mol/L氯化鉀溶液，應(yīng)保持有2/3以上；9.耐破儀（包

9、材檢測）：1）硅油裝量應(yīng)在1/2以上；2）膠膜必須凸起成球面狀，并略低于下夾盤表面；3）打開氣源，氣壓應(yīng)控制在0.3-0.4兆帕之間10.邊壓儀（包材檢測）：1）應(yīng)及時更換刀片（可觀察所取待測試樣是否有毛邊）；2）配備專用導(dǎo)塊11.涂膜厚度測定儀：1）開機(jī)后Error指示燈應(yīng)在熄滅狀態(tài)；2）儀器校準(zhǔn)后，測樣顯示數(shù)值應(yīng)穩(wěn)定，不能有大幅跳動情況；3）檢測夾具導(dǎo)電膠粒應(yīng)無破損、無明顯劃痕；4）應(yīng)備有校準(zhǔn)板四、 在線實驗室管理1、 各檢測儀器和試劑瓶等要求分類擺放整齊；各儀器外表干凈整潔、玻璃器皿干凈、無破損；檢測室臺面、地面干凈，無明顯結(jié)垢情況。2、 在線使用的糖度計、分光光度計、pH計、離心機(jī)等使

10、用和維護(hù)正常，具體要求同實驗室。五、 實驗室安全及防護(hù)知識1、 實驗室危險性種類1) 易燃、易爆危險2) 有毒氣體危險3) 機(jī)械傷害危險4) 觸電危險5) 放射性、微波輻射、電磁、電場等其他危險2、 實驗室通用安全守則1) 實驗室人員必須熟悉儀器、設(shè)備的性能和使用方法，按規(guī)定要求進(jìn)行操作。2) 凡進(jìn)行有危險性實驗，實驗人員應(yīng)先檢查防護(hù)措施，確證防護(hù)妥當(dāng)后，才可進(jìn)行操作。實驗過程中操作人員不得擅自離開，實驗完成后立即做好善后清理工作，并作出記錄。3) 凡有毒或有刺激性氣體發(fā)生的實驗、應(yīng)在通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行，做好個人防護(hù)、不得把頭部伸進(jìn)通風(fēng)柜內(nèi)。4) 凡接觸或使用腐蝕和刺激性藥品，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氨水、過

11、氧化氫、冰醋酸等，取用時盡可能佩帶橡皮手套和防護(hù)眼鏡，瓶口不要直接對著人，禁用裸手直接拿取上述物品。開啟有毒氣體容器時應(yīng)帶防毒面具。5) 不使用無標(biāo)簽（或標(biāo)志）容器盛放的試劑、試樣。6) 實驗中產(chǎn)生的有毒、有害廢液、廢物應(yīng)集中處理，不得任意排放或流入下水道。酸、堿或有毒物品濺落時，應(yīng)及時清理及除毒。7) 嚴(yán)格遵守安全用電規(guī)程。不使用絕緣不良或接地不良的電氣設(shè)備，不準(zhǔn)擅自拆修電器。8) 安裝能發(fā)生破裂的玻璃儀器時，要用布巾包裹。往玻璃管上套橡皮管時，管口應(yīng)燒圓滑，并用水或甘油潤滑，防止玻璃管破裂割傷手。9) 實驗完畢，實驗人員應(yīng)養(yǎng)成洗手離開的習(xí)慣。實驗室內(nèi)禁止吸煙和存放食物、食具（食品感官鑒評實

12、驗室例外）。10) 實驗室應(yīng)配備消防器材。實驗人員要熟悉其使用方法并掌握有關(guān)的滅火知識。11) 實驗結(jié)束，人員離室前要檢查水、電、燃起和門窗，確保安全，并作好登記。3、 常見的實驗室事故急救和處理1) 實驗室滅火實驗室滅火的原則是：移去或隔絕燃料的來源，隔絕空氣（氧氣）、降低溫度。2) 化學(xué)物質(zhì)中毒及灼傷的急救i. 有毒氣體的中毒:常見有毒氣體有氯氣、硫化氫、氮氧化物、一氧化碳等。如果一旦發(fā)生中毒，要立即離開現(xiàn)場，將中毒者抬到空氣新鮮處，報警或送醫(yī)院急救。ii. 強(qiáng)酸、強(qiáng)堿灼傷：受到硫酸、鹽酸、硝酸傷害時，立即用大量水沖洗，然后用2的小蘇打水沖洗患部；受到NaOH、KOH 溶液傷害時，迅速用大

13、量水沖洗，再用2稀醋酸或2硼酸充分洗滌傷處。遇有衣服粘連在皮膚上，切忌撕開或揭開，以防破壞皮膚組織，大量沖水后再送醫(yī)院由醫(yī)生處理。3) 觸電的急救遇到人身觸電事故時，必須保持冷靜，立即拉下電閘斷電，或用木棍將電源線撥離觸電者。千萬不要徒手和腳底無絕緣體情況下去拉觸電者。如人在高處，要防止切斷電源后把人摔傷。脫離電源后，檢查傷員呼吸和心跳情況。若呼吸停止，立即進(jìn)行人工呼吸，并報警呼救。六、 微生物基本知識微生物（microorganism, microbe）是一些肉眼看不見的微小生物的總稱。l 微生物種類繁多，至少有十萬種以上。按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及生活習(xí)性等差異可分成三大類。 l 真核細(xì)胞型微生

14、物：真菌屬于此類型微生物。霉菌的繁殖方式為分生孢子；酵母為出芽繁殖。l 原核細(xì)胞型微生物：這類微生物種類眾多，有細(xì)菌、螺旋體、支原體、立克次體、衣原體和放線菌。細(xì)菌的繁殖方式為二分裂繁殖。l 非細(xì)胞型微生物：病毒屬于此類型微生物。 l 微生物的特點：l 分布廣，種類多（10萬多種）l 生長旺，繁殖快l 適應(yīng)性強(qiáng)，易變異l 代謝強(qiáng)，轉(zhuǎn)化快七、 微生物檢驗基本手段和準(zhǔn)備工作l 顯微技術(shù)l 普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)和基本原理：ú 結(jié)構(gòu)：光學(xué)顯微鏡是由光學(xué)放大系統(tǒng)和機(jī)械裝置兩部分組成。l 普通顯微鏡的使用方法ú 低倍鏡觀察：先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動反光鏡，調(diào)好光線

15、，將物鏡提高，向下調(diào)至看到標(biāo)本，再用細(xì)調(diào)對準(zhǔn)焦距進(jìn)行觀察。ú 高倍鏡觀察：低倍鏡對準(zhǔn)焦點后，轉(zhuǎn)換到高倍鏡基本上也對準(zhǔn)焦點，只要稍微轉(zhuǎn)動微調(diào)即可。ú 油浸鏡觀察：油浸鏡的工作距離很小，所以要防止載皮片和物鏡上的透鏡損壞。使用時，一般是經(jīng)低倍、高倍到油浸鏡。當(dāng)高倍物鏡對準(zhǔn)標(biāo)本后，再加油浸鏡觀察。載玻片上加油以后，將油浸鏡下移到油滴中，到停止下降為止，然后用微調(diào)向上調(diào)準(zhǔn)焦點。l 普通顯微鏡的保養(yǎng)觀察完后，移去觀察的載玻片標(biāo)本。用過油浸鏡的，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭23次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，放在低倍鏡的位置。將鏡身向下降到最低

16、位置，調(diào)節(jié)好鏡臺上標(biāo)本移動器的位置，罩上防塵套。l 染色技術(shù)除了觀察活體微生物細(xì)胞的運動性和直接計算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后，才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察。ú 革蘭氏染色法： ú 細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌紫色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性番紅或石炭酸復(fù)紅等進(jìn)行復(fù)染。陽性菌仍帶藍(lán)紫色，陰性菌則被染上紅色。ú 革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟l 滅菌和消毒 消毒和滅菌兩個詞在實

17、際使用中常被混用，其實它們的含義是有所不同的。消毒是指應(yīng)用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營養(yǎng)體的方法；滅菌是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物，使之呈無菌狀態(tài)。l 物理方法ú 干熱滅菌法：包括灼燒滅菌法和干熱空氣滅菌法,干熱空氣滅菌法是實驗室中常用的一種方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160，恒溫2小時即可。此法適用于玻璃器皿、金屬用具等的滅菌。ú 濕熱滅菌法: 在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好，這是因為高溫水蒸汽對蛋白質(zhì)有高度的穿透力，從而加速蛋白質(zhì)變性而迅速死亡。ú 加壓蒸汽滅菌法：這是發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健、食品檢測

18、和微生物學(xué)實驗室中最常用的一種滅菌方法。它適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)基的滅菌，也適用于玻璃器皿、工作服等物品的滅菌。在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個問題是，在恒壓之前，一定要排盡滅菌鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對應(yīng)關(guān)系，這樣會大大降低滅菌效果。l 化學(xué)方法一般化學(xué)藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微生物培養(yǎng)基制備在實驗室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質(zhì)，都叫做培養(yǎng)基(Media)。根據(jù)某種標(biāo)準(zhǔn)，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型。根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分，可以分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。八、 微生物檢樣的采集1樣品原則根據(jù)

19、檢驗?zāi)康?、食品特點、批量、檢驗方法、微生物的危害程度等確定采樣方案。應(yīng)采用隨機(jī)原則進(jìn)行采樣，確保所采集的樣品具有代表性。采樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。樣品在保存和運輸?shù)倪^程中，應(yīng)該采取必要的措施防止樣品中原有微生物的數(shù)量變化，保持樣品的原有狀態(tài)。2采樣方案分為二級和三級采樣方案。二級采樣方案設(shè)有、和值，三級采樣方案設(shè)有、和值。：同一批次產(chǎn)品應(yīng)采集的樣品件數(shù)；：最大可允許超出值的樣品數(shù)；：微生物指標(biāo)可接受水平的限量值；：微生物指標(biāo)的最高安全限量值。注：按照二級采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在個樣品中，允許有個樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值大于m。注2：按照三級采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在n個樣品

20、中，允許全部樣品中相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值小于或等于m值；允許有c個樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值在m值和M值之間；不允許有樣品相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值大于M值。九、 食品微生物學(xué)常規(guī)檢驗技術(shù)關(guān)于GB 4789.1-2010食品微生物學(xué)檢驗 總則的新增的描述:與GB/T4789.1-2003相比新國標(biāo)GB4789.1-2010總則增加了微生物實驗室的基本要求，包括環(huán)境、人員、設(shè)備要求：病源菌應(yīng)在二級安全實驗室內(nèi)進(jìn)行；檢驗人員應(yīng)具有相應(yīng)的教育、微生物專業(yè)培訓(xùn)經(jīng)歷，具備相應(yīng)的資質(zhì)；實驗設(shè)備應(yīng)有日常性監(jiān)控記錄和使用記錄；實驗室應(yīng)定期對實驗人員進(jìn)行技術(shù)考核和人員比對。菌落總數(shù)測定檢驗方法參見GB4789.2-20

21、10食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定菌落總數(shù)的概念是什么？ 菌落總數(shù)就是指在一定條件下（如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時間等）每克（每毫升）檢樣所生長出來的細(xì)菌菌落總數(shù)。按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定，即在需氧情況下，36培養(yǎng)48h，能在PCA瓊脂平板上生長的細(xì)菌菌落總數(shù)。菌落總數(shù)能不能代表所有細(xì)菌總數(shù)？ 由于菌落總數(shù)培養(yǎng)的條件（如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時間等）決定，厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌，難以繁殖生長。因此菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細(xì)菌總數(shù)。為什么檢測微生物要注意無菌操作？它包括哪些方面？ 操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必

22、須是完全滅菌的，不得殘留有細(xì)菌或抑菌物質(zhì)。所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行消毒處理。樣品如果有包裝，應(yīng)用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺或經(jīng)過消毒處理的無菌室進(jìn)行。超凈工作臺的空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn)要求達(dá)到百級標(biāo)準(zhǔn)，即瓊脂平板在工作臺暴露30分鐘，每個平板不得超過1個菌落。檢測固體樣品時，為什么取樣時不應(yīng)集中一點，宜多采幾個部位？ 固體樣品必須經(jīng)過多點取樣，才能使取樣有代表性，使實驗結(jié)果更接近真實值。為什么傾注培養(yǎng)基不宜過多或過少？ 傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，一般以15mL較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。針對不同的稀釋度，怎樣計算菌落總數(shù)？ 計數(shù)時應(yīng)選取菌落數(shù)在3030

23、0之間的平板。若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克（毫升）中菌落總數(shù)結(jié)果。若有兩個連續(xù)稀釋度在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，只計數(shù)在30300個菌落數(shù)的平板，按如下公式計算：N=C/（n1+0.1 n2）dN 樣品中菌落數(shù)C 平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和n1  適宜范圍菌落數(shù)的第一稀釋度（低）平板個數(shù)n2  適宜范圍菌落數(shù)的第二稀釋度（高）平板個數(shù)d  稀釋因子（第一稀釋度）若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以

24、最高稀釋倍數(shù)計算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。傾注用培養(yǎng)基為什么溫度不能太高？ 傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46水浴內(nèi)保溫，溫度太高的培養(yǎng)基會導(dǎo)致微生物死亡，影響實驗結(jié)果。當(dāng)平板上有鏈狀菌落或片狀菌落生長時，應(yīng)怎樣計數(shù)？ 當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)

25、按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。菌落數(shù)應(yīng)怎樣報告？ 菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按“四舍五入”方式修約，采用兩位有效數(shù)字報告。大于或等于100時，前第3位數(shù)字采用“四舍五入”方式修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可用10的指數(shù)形式來表示，此時也按“四舍五入”方式修約，采用兩位有效數(shù)字。若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。l 大腸菌群測定檢測標(biāo)準(zhǔn)參見：GB 4789.3-2010

26、食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)第一法 大腸菌群MPN計數(shù)1.樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225 ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min10000 r/min均質(zhì)1min2 min，或放入盛有225 ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2 min，制成1：10的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管吸取25ml樣品，置盛有225 ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1：10的樣品勻液。樣品勻液的pH值應(yīng)在6.57.5之間，必要時分別用1mol/L氫氧化鈉或1

27、mol/L鹽酸調(diào)節(jié)。用1ml無菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1ml，沿管壁緩緩注入9 ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1ml無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋一次，換用一支1ml無菌吸管或吸頭，從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。2.初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯，每管接種1ml（如接種量超過1ml，則用

28、雙料LST肉湯），36±1培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h。記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗。3.復(fù)發(fā)酵試驗用接種環(huán)從所有48h±2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物一環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯管中，36±1培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。4.大腸菌群最可能數(shù)的報告根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN表，報告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。第二法 大腸菌群平板計數(shù)1.樣品的稀釋2 平板計數(shù)選取2個

29、3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿，每皿1ml，同時分別取1ml生理鹽水加入兩個無菌平皿做空白對照。及時將15ml20ml冷至46的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂約傾注于每個平皿中，小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3ml4mlVRBA覆蓋平板表層，翻轉(zhuǎn)平板，置于36±1培養(yǎng)18h24h。3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15150之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。4 證實試驗從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36

30、7;1培養(yǎng)24h48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。5 大腸菌群平板計數(shù)的報告經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以8.3中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸菌群。例：10-4樣品稀釋液1ml，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×610×104g（ml）=6.0×105CFUg（ml）。l 霉菌和酵母菌及其檢驗l 檢測標(biāo)準(zhǔn)參見：GB4789.15-2010，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)l 霉菌和酵

31、母菌落的形態(tài)區(qū)別？ú 酵母菌是真菌中的一大類，通常是單細(xì)胞，呈圓形,卵圓形、臘腸形或桿狀。ú 霉菌也是真菌，能夠形成疏松的絨毛狀的菌絲體的真菌稱為霉菌。l 在霉菌和酵母計數(shù)中，主要使用哪些培養(yǎng)基？ú 可以使用馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、孟加拉紅（虎紅）培養(yǎng)基l 霉菌及酵母菌落計數(shù)及報告應(yīng)注意哪幾點？選取菌落數(shù)10-150之間的平板進(jìn)行計數(shù)。一個稀釋度使用兩個平板，取兩個平板菌落數(shù)的平均值，乘以稀釋倍數(shù)報告。l 為什么霉菌及酵母的培養(yǎng)溫度和檢測菌落總數(shù)的培養(yǎng)溫度不同？大多數(shù)霉菌和酵母在2530的情況下生長良好，因此培養(yǎng)溫度28，而大多數(shù)細(xì)菌在36的情況下生

32、長良好，因此培養(yǎng)溫度3537。l 耐熱芽孢菌的檢驗l 樣品準(zhǔn)備ú 在無菌操作條件下，將10mL室溫狀態(tài)下的待檢樣品加入一個滅菌試管中，蓋好棉塞。ú 在同直徑的試管中加入10mL同樣室溫狀態(tài)下的水，并插入溫度計。ú 將兩試管同時放入100水浴中保溫。當(dāng)水中的溫度達(dá)到100時開始計時。ú 計時達(dá)10分鐘后，迅速將樣品管取出，置于常溫水中迅速降溫至室溫。l 培養(yǎng)基準(zhǔn)備ú 檢查預(yù)先經(jīng)過滅菌處理的錳鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基是否處于正常。（每1000mL營養(yǎng)瓊脂加入無菌硫酸錳水溶液1mL。100mL蒸鎦水溶解3.08g硫酸錳。）ú 將滅菌培養(yǎng)基加熱融化后

33、，在46水浴中保溫用。l 接種培養(yǎng)ú 在無菌操作條件下，在一個滅菌平皿內(nèi)傾入15mL錳鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并暴露至接種過程結(jié)束，標(biāo)記后以作為環(huán)境對照樣品。ú 在無菌操作條件下，用1mL的滅菌吸管移取1mL選定的樣品稀釋液或樣品原樣至滅菌平皿內(nèi)。ú 同上對同一樣品重復(fù)操作。即每個選定的樣品稀釋度做兩個平皿。ú 按以上步驟，以1mL毫升無菌生理鹽水作為空白操作對照。ú 在無菌操作條件下，將約15mL錳鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入樣品平皿中，將平皿置于操作臺面上輕輕轉(zhuǎn)動，使樣品和培養(yǎng)基混勻。ú 待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，即保持有標(biāo)記和培養(yǎng)基的一面向上

34、。將所有平皿（包括空白和環(huán)境對照）置于55±1的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，保溫48小時。l 計數(shù)及報告ú 關(guān)于稀釋倍數(shù)的選擇可參考細(xì)菌菌落總數(shù)測定。l 芽孢總數(shù)測定的檢驗l 樣品準(zhǔn)備ú 在無菌操作條件下，將10mL室溫狀態(tài)下的待檢樣品加入一個滅菌試管中，蓋好棉塞。ú 在同直徑的試管中加入10mL同樣室溫狀態(tài)下的水，并插入溫度計。ú 將兩支試管同時放入80水浴中保溫，當(dāng)水中的溫度達(dá)到80時開始計時。 ú 計時10分鐘后，迅速將樣品管取出，置于常溫水中迅速降溫至室溫。l 培養(yǎng)基準(zhǔn)備ú 檢查預(yù)先經(jīng)過滅菌處理的錳鹽營養(yǎng)瓊脂（每1000mL營養(yǎng)瓊脂加入無菌硫酸錳水溶液1mL。100mL蒸鎦水溶解3.08g硫酸錳。）是否處于正常。l 接種培養(yǎng)ú 在無菌操作條件下，在一個滅菌平皿內(nèi)傾入15mL錳鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并暴露至接種過程結(jié)束，標(biāo)記后以作為環(huán)境對照