觀察分析不同環(huán)境因素對小鼠應(yīng)激反應(yīng)的作用.docx

1、.論著*觀察分析不同環(huán)境因素對小鼠應(yīng)激反應(yīng)的作用周小江，邵青，張新創(chuàng)(蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，蘭州730046)摘要：目的觀察小鼠在領(lǐng)用、運(yùn)輸過程中的環(huán)境變化引起的小鼠應(yīng)激反應(yīng)，并根據(jù)體重變化、蔗糖水偏嗜度變化、曠場行為得分來分析小鼠應(yīng)激反應(yīng)對機(jī)體產(chǎn)生的影響。方法SPF級BALB/c、IH、KM小砒隨機(jī)分為試騎組和對照組，在模擬外部5種剌激試驗(yàn)后，記錄體或、蔗糖水和純水消耗量并計(jì)算出蔗糖水偏嗜度、曠場活動數(shù)據(jù)°結(jié)果3種小鼠試驗(yàn)組在刺激后的體重比對照組明顯減輕;曠場活動計(jì)數(shù)有相對應(yīng)的變化;試驗(yàn)組蔗糖水偏嗜度比對照組下降明顯，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

2、;0.05)o結(jié)論研究初步表明試驗(yàn)前的應(yīng)激刺激會影響實(shí)驗(yàn)小鼠的精神狀態(tài)。關(guān)鍵詞：應(yīng)激;動物福利；蔗糖水偏嗜度;曠場實(shí)騎中圖分類號：Q958.11文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1005-5673(2013)02-0033-04ObservationandanalysiseffectfromdifferentenvironmentalfactorsonthestressresponseinmiceZHOUXiao-jiang,SHAOQing,ZHANGXinYhuang(LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.Ltd,CerUerforGansuProvincia

3、lVaccitieEngineeringResearchtIxinzhou730046,China)Abstract:ObjectiveTheobservationwascarriedoutontheeffectofenvironmentalchangesuponmiceduringreceptionandtransportationofthem.andtheintensityofthestressresponseinmicewasanalysedbasedonchangeinbodyweight,changeinaddicteddegreeforpreferencetosucroseandt

4、hescoresbyopen-fieldbehavior.MethodsTheBALB/c,NIH,KMmiceinSPFlevelwererandomlydividedintoexperimentalandcontrolgroups,respectively,recordedingbodyweight,consumptionofsucrosewaterandpurewater,preferencetosucrose,anddatafromopen-fieldactivityafterthefiveexternalstimulativetestsweresimulated.ResultsHie

5、bodyweightsofmiceafterstimulationinthreetestgroupsaresignificantlylowerthanthoseinthecontrolgroup,andthecorrespondingchangesoccurredinthescoresofopen-fieldactivityandthesucrosepreferenceintestgrouparesignificantlydecreasedincomparisonwiththoseinthecontrolgroup,andthedifferencesarestatisticallysignif

6、icant(P<0.05).ConclusionInthisstudythestressstimulationoccuredbeforethetest,whichwillaffectthementalstateoftheexperimentalmice.Keywords：Stress;Animalwelfare;Sucrosepreference;Open-fieldtest隨著中國實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)化程度的提高，實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)環(huán)境不斷得到改善,SPF飼養(yǎng)設(shè)施廣泛應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)動物行業(yè)中，為實(shí)驗(yàn)動物的質(zhì)量提供了保證。但由于在實(shí)驗(yàn)動物從運(yùn)輸?shù)皆囼?yàn)前的過程中受外界多種因素的影響，會引起實(shí)驗(yàn)動物的

7、應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物行為發(fā)生變化，影響實(shí)驗(yàn)動物在試驗(yàn)中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。收稿日期：2012-12-03；修回日期：2013-0116作者簡介:周小江(1968-).男.醫(yī)學(xué)生物程師，主要從事實(shí)驗(yàn)動物微生物檢測工作C應(yīng)激(Stress)是機(jī)體對不協(xié)調(diào)狀態(tài)或環(huán)境穩(wěn)定受到威脅時所做出的反應(yīng)。一般伴有神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫和行為的變化來完成身體對應(yīng)激的應(yīng)答。目前，國內(nèi)對實(shí)驗(yàn)動物在離開動物飼養(yǎng)設(shè)施到動物試驗(yàn)前這一過程中所產(chǎn)生的一系列應(yīng)激反應(yīng)越來越受到關(guān)注。有文獻(xiàn)報(bào)道實(shí)驗(yàn)動物在外界應(yīng)激刺激后，對實(shí)驗(yàn)動物自身的免疫系統(tǒng)存在著干擾，從而影響動物試驗(yàn)的結(jié)果，'51o通過實(shí)驗(yàn)室模擬動物運(yùn)輸、外界溫濕度變化以及人為

8、不規(guī)范操作等因素引起的應(yīng)激,在體重、蔗糖偏嗜度、曠場行為試驗(yàn)的數(shù)據(jù)變化來觀察實(shí)驗(yàn)動物從離開動物飼養(yǎng)設(shè)施到試驗(yàn)前這一過程的應(yīng)激程度，確定對實(shí)驗(yàn)動物機(jī)體的影響。同時通過實(shí)驗(yàn)室模擬外界環(huán)境因素變化的方法，避免了不確定因素的發(fā)生和干擾，有利于觀察和研究單一因素對實(shí)驗(yàn)動物的影響,旦存在著從試驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)計(jì)、易于操作和控制、人為干擾因素少等優(yōu)點(diǎn)，為在這個領(lǐng)域的研究提供一些參考數(shù)據(jù)和試驗(yàn)方法。1材料和方法11材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級BALB/c、NIH、KM小鼠均獲自蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司（以下簡稱蘭州公司）實(shí)驗(yàn)動物室，生產(chǎn)許可證號:SCXK（甘）2012-0001,使用許可證號:SYXK（t）-

9、）2012-0002o1.1.2天平、搖床、批筒、孵育箱、冰箱等均為蘭州公司實(shí)驗(yàn)動物室檢測組常用設(shè)備，均經(jīng)甘肅省氣象計(jì)最檢定站校驗(yàn)合格。1.2試驗(yàn)方法1.2.1稱重方法將SPF級BALB/c、N1H、KM小鼠分別設(shè)置為試驗(yàn)組和對照組,每蛆隨即挑選1。只小鼠，雌雄各半。體重稱重時間為:首次:兩組小鼠稱取體重;剌激前：72h蔗糖水、純化水雙瓶適應(yīng)性飼養(yǎng)后，稱取體重;刺激1:禁食禁水18h后稱取體重;刺激2：蔗糖水、純化水雙瓶飼養(yǎng)24h后試驗(yàn)組進(jìn)行模擬五項(xiàng)刺激試驗(yàn)，對照組正常飼養(yǎng)后稱取體重;刺激3：重復(fù)刺激2試驗(yàn)稱取體重；刺激后:重復(fù)刺激2試驗(yàn)稱取體重;恢復(fù)后:停止刺激并蔗糖水、純化水雙瓶飼養(yǎng)72h

10、后稱重。1.2.2糖水偏嗜度試驗(yàn)力將兩組小鼠進(jìn)行72h蔗糖水、純化水雙瓶適應(yīng)性飼養(yǎng)。蔗糖水濃度為1%;純化水為蘭州公司培養(yǎng)基室制作，為防止小鼠對蔗糖水的依賴性，每12h兩種水交換位置。刺激試驗(yàn)前禁食禁水18h,五項(xiàng)刺激試驗(yàn)開始，加入蔗糖水、純化水分別為100mL雙瓶飼養(yǎng)。剌激試驗(yàn)72h后通過量筒計(jì)量糖水、純化水消耗量并計(jì)算出糖水偏嗜度（%）。糖水偏嗜度（%）=糖水消耗量/（糖水消耗量+純化水消耗量）x100%o1.2.3曠場行為試驗(yàn)曠場（Openfield）試驗(yàn)箱為蘭州公司自制木箱，根據(jù)小鼠身長其設(shè)計(jì)大小為40cmx40cmx30cm,內(nèi)外均為黑色，用白線平均分為25個方格的曠場箱。計(jì)分方法:

11、試驗(yàn)期間觀察動物每走一格為1分，雙足離地站立為1分，前爪整理毛發(fā)為I分，爬墻一次為1分，記錄時間為3min。1.2.4模擬外界五項(xiàng)刺激試驗(yàn)固定試驗(yàn):將試驗(yàn)動物固定在自制的固定板，時間為3min,要求不能損傷小鼠四肢，固定背部;暈車試驗(yàn):使用設(shè)備為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)用搖床,生產(chǎn)廠家為:海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號:TS-2。搖床設(shè)置為每分鐘晃動100次，晃動3min；嚴(yán)寒試驗(yàn)：-20°C冰柜內(nèi)放置3min；酷熱試驗(yàn)：30T孵育箱放置3min；浸濕試驗(yàn):燒杯內(nèi)盛適屈室溫純化水，浸濕3次。以上試驗(yàn)每天進(jìn)行2次,直到刺激試驗(yàn)結(jié)束。1.2.5恢復(fù)試驗(yàn)將試驗(yàn)組和對照組小鼠,在刺激試驗(yàn)結(jié)束后,進(jìn)行

12、相同方式（蔗糖水、純化水雙瓶）飼養(yǎng)3d,然后測定體童、蔗糖水偏嗜度、曠場行為數(shù)值。1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，全部數(shù)據(jù)以土s表示,組間差異比較采用七檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1BALB/c小鼠試驗(yàn)前試驗(yàn)組、對照組平均體重分別為13.62g、13.34g;試驗(yàn)后試驗(yàn)組、對照組平均體重分別是19.18g、20.22g；恢復(fù)3d平均體重試驗(yàn)組、對照組分別為23.24g和24.12g（見圖1）。曠場行為計(jì)數(shù)如表1所示，試驗(yàn)前和恢復(fù)3d后兩組問數(shù)值無顯著性差異，試驗(yàn)后兩組間數(shù)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；蔗糖偏嗜度結(jié)果如表2

13、所示，試驗(yàn)前和恢復(fù)3d后兩組間數(shù)值無顯著性差異，試驗(yàn)后兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PvO.05）o圖1BALB/c、NIH、KM小鼠體重Fig.IThebodyweightofBALB/c,NIHandKMmice2.2NIH小鼠試驗(yàn)前試驗(yàn)組、對照組平均體重分別為16.56g、16.58g;試驗(yàn)后試驗(yàn)組、對照組平均體重分別是22.13g、23.12g；恢復(fù)3d后平均體重試驗(yàn)組、對照組分別為21.38g和24.74g（見圖1）。曠場行為計(jì)數(shù)如表1所示,試驗(yàn)前、后兩組間數(shù)值無顯著性差異，恢復(fù)3d后數(shù)值有顯著性差異（P<0.05），分析NIH小鼠在感受刺激方面有一定延遲性表現(xiàn)，試驗(yàn)后數(shù)值未出現(xiàn)差異

14、，但精神狀態(tài)表現(xiàn)為膽怯、易驚嚇等;蔗糖水偏嗜度結(jié)果如表2所示，試驗(yàn)前和恢夏3d后兩組間數(shù)值無顯著性差異，試驗(yàn)后兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2.3KM小鼠試驗(yàn)前試驗(yàn)組、對照組平均體重分別為18.38g、18.18g;試驗(yàn)后試驗(yàn)組、對照組平均體重分別是23.82g、26.10g；恢復(fù)3d后平均體重試驗(yàn)組、對照組分別為30.00g和30.08g（見圖1）。曠場行為計(jì)數(shù)如表1所示，試驗(yàn)前兩組數(shù)值無顯著性差異，試驗(yàn)后和恢復(fù)3d后數(shù)值均有顯著性差異（P<0.05）；蔗糖水偏嗜度結(jié)果如表2所示，試驗(yàn)前和恢復(fù)3d后兩組間數(shù)值無顯著性差異，試驗(yàn)后兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（尹<0.05

15、）。表1曠場試驗(yàn)結(jié)果Tab.1Theresultsofopen-fieldtestBALB/cNIHKMx±s*為P<0.05試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)前41±3621±17106±37134±2072±3284±42試驗(yàn)后46±4083±22*103±6391±6031±30127±5*恢復(fù)后75±4145±2759±41118±32*38±2887±57表2蔗糖水由度試驗(yàn)結(jié)果Tab.

16、2Thedataofsucrosepreference*為P<0.05X±3BALB/cN1HKM試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)組對照組試驗(yàn)前0.51±0.200.61±0.140.63±0.060.60±0.050.70±0.120.65±0.02試驗(yàn)后0.46±0.120.57±0.07*0.57±0.050.64±0.08,0.68±0.040.75±0.06*恢復(fù)后0.54±0.110.63±0.100.64±0.040.6

17、3±0.120.71±0.040.72±0.083討論試驗(yàn)通過模擬外界不良因素來誘導(dǎo)小鼠焦慮、恐慌、萎靡、膽怯等精神癥狀,測定小鼠從離開動物飼養(yǎng)設(shè)施到試驗(yàn)場所試驗(yàn)前的刺激強(qiáng)度，探討減輕外界因素刺激小鼠的必要性，并為改善這一過程的刺激強(qiáng)度，提供了一定的參考數(shù)據(jù)。在模擬外界刺激因素的試驗(yàn)方法時，借鑒了文獻(xiàn)8中的一些想法，并且通過在實(shí)驗(yàn)室模擬一些特殊形式比如短途運(yùn)輸造成的顛簸、暈車、溫濕度急劇變化、飼喂動物時漏水等因素設(shè)計(jì)出暈車試驗(yàn)、嚴(yán)寒試驗(yàn)、酷熱試驗(yàn)和浸濕試驗(yàn)，設(shè)計(jì)時間均為3min,比實(shí)際因素時間要短，但通過每天2次試驗(yàn)來完成對現(xiàn)實(shí)中應(yīng)激因素的模擬，同樣達(dá)到了預(yù)期目的

18、。根據(jù)表1所示,SPF級別3種小鼠在曠場行為試驗(yàn)中，數(shù)據(jù)變化復(fù)雜，雖然BALB/c和KM小鼠對照組數(shù)據(jù)變化不穩(wěn)定（口J能與試驗(yàn)的計(jì)分方法有關(guān)，有必要在今后試驗(yàn)中繼續(xù)探索改進(jìn)），但從試驗(yàn)組小鼠試驗(yàn)后行為表現(xiàn)為弓背行走,對聲響敏感的恐懼、膽怯癥狀來看，與對照組小鼠曠場內(nèi)表現(xiàn)出的悠閑、探索行為有明顯外觀差異，數(shù)據(jù)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)過模擬5項(xiàng)試驗(yàn)刺激，試驗(yàn)組體重比對照組體重明顯減輕，且差異性趨勢越來越顯著。而經(jīng)過3d恢復(fù),差異性趨勢逐步減緩，證明試驗(yàn)小鼠在一定應(yīng)激刺激后，如果有良好的飼養(yǎng)管理，在一定的時間內(nèi),體重會有程度不同的恢復(fù)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，糖水偏嗜度試驗(yàn)組與對照組數(shù)據(jù)

19、存在顯著性差異（P<0.05）。試驗(yàn)中試驗(yàn)組小鼠在模擬外界五種刺激試驗(yàn)后,對糖水的偏好降低，說明缺乏快樂感受，對飼養(yǎng)過程中蔗糖獎賞的獲取欲望減弱，表現(xiàn)出萎靡，恐慌、膽怯等精神癥狀。在經(jīng)過3d恢復(fù)飼養(yǎng)試驗(yàn)后，蔗糖水偏嗜度試驗(yàn)組與對照組有接近的趨勢，恢復(fù)飼養(yǎng)對小鼠應(yīng)激剌激有恢復(fù)作用。綜上所述，SPF級BALB/c、NIH、KM小鼠在刺激試驗(yàn)前后行為學(xué)指標(biāo)發(fā)生相應(yīng)變化，試驗(yàn)組小鼠在各種刺激試驗(yàn)后精神狀態(tài)變差，與對照組有比較明顯的行為差異，而這種差異可能影響試驗(yàn)小鼠在未來試驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。SPF級小鼠是生活在SPF飼養(yǎng)設(shè)施內(nèi)的實(shí)驗(yàn)動物，飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定,飼養(yǎng)人員固定，飼養(yǎng)管理有嚴(yán)格的國家標(biāo)準(zhǔn)控制，而

20、在離開SPF飼養(yǎng)設(shè)施后，外界未知因素增加，這些因素有可能導(dǎo)致小鼠短時間內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。為了確保實(shí)驗(yàn)動物在試驗(yàn)前減少或降低外界因素的影響,應(yīng)在動物領(lǐng)用、運(yùn)輸和人員操作推行標(biāo)準(zhǔn)化管理，包括對動物運(yùn)輸中的運(yùn)輸工具、包裝盒、墊料、食物、飲水、恒溫、恒濕的綜合性要求。而在恢復(fù)試驗(yàn)中，通過正常的飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3種小鼠在體重、糖水偏嗜度和曠場行為數(shù)據(jù)中都有一定程度的恢復(fù)，表明如果在一個相對穩(wěn)定環(huán)境中進(jìn)行恢復(fù)性飼養(yǎng)，可以減輕應(yīng)激刺激帶來的不良影響。參考文獻(xiàn)1GB14925-2010,實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境及設(shè)施S.2 MobergCP.MenchJA.動物應(yīng)激生物學(xué)M.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2005:28-41.3 Rey

21、esTM,WalkerJRDeCinoC.ela.Categoricallydistincta-cutestressorselicitdissimilartranscriptionalprofilesintheparaventricularnucleusof(hrhypothalamusJ1.Ncurwci.2(X)3,(23):5607-5616.'4SgoifoA,PozzatoC,MeerioP,etal.Inlrnnittentexposuretosocialdefeatandopen-fieldtestinrats:acuteandlong-termeffectsonE(；(

22、；,bodytemperatureandphysicalactivityJ.Stress,2002,5(1):23-35.5,DeCarutR,AsnisGM.Thenon-steroidalanti-inflammatorydrugdiclofenacsodiumattenuatasIFN-alphainducedalterationstomonoamineturnoverinprefrontalcortexandliippocampus(J.BrainResearch,2003,977(1)：70-79.6j施桂蘭，庫寶善，姚海燕.解郁丸對慢性應(yīng)激大W.HPA軸和免疫系統(tǒng)的影響J.中國中藥雜志,2007.32(15):1553-1554.L7BrenesSaenzJC,VillagniOR,FoniagueraTJ.Factoranalysisofforcedswimmingtest,sucrosepreferencetestandop