血管肽對離體大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和c-mybmRNA表達(dá)的影響

1、    血管肽對離體大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和c-myb mRNA表達(dá)的影響        【摘要】目的觀察了血管肽(angiopeptim，AP)對血小板源性生長因子刺激下離體大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖和c-myb mRNA表達(dá)的影響，從分子生物學(xué)水平探討其抗增殖作用機(jī)制。方法采用細(xì)胞計(jì)數(shù)確定VSMC增殖狀態(tài)。以Nothern印跡法測定c-myb mRNA表達(dá)水平。結(jié)果各組細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(5.45±0.57)×104，對照組；(4

2、.12±0.13)×104,30 nmol/L；(3.13±0.20)×104,60 nmol/L和(2.03±0.05)×104，120 nmol/L；(q=10.50,10.32和27.01，P<0.01)。抑制率分別為29%，52%和77%。其對VSMC c-myb mRNA表達(dá)的抑制也具劑量依賴性。c-myb mRNA/GAPDH比值分別為1.12±0.02(對照組)；0.61±0.01,30 nmol/L;0.34±0.01,60 nmol/L和0.16±0.01,120 nmo

3、l/L;q=39.23,60.00和73.85,P<0.01)。結(jié)論血管肽顯著抑制VSMC增殖及c-myb原癌基因表達(dá)，作用呈劑量依賴性。提示AP抗增殖作用與抑制晚期生長調(diào)節(jié)基因表達(dá)有關(guān)。【關(guān)鍵詞】血管平滑肌細(xì)胞； 血管肽； 癌基因Effects of angiopeptin on expression of c-myb mRNA in rat vascular smooth muscle cellsXi Yongan, Wang Lihui, Tang Chaoshu.(Department of Cardiology, First Hospital of Beijing Medica

4、l University, Beijing 100034)【Abstract】ObjectiveOncogenes play an important role in cell growth and differentiation. Angiopeptin (AP) has been shown to be a potent antiproliferative agent for various cell types. The mechanism of AP on the VSMC proliferation is unclear. The aim of this study was to a

5、nalyze the effects of AP on proliferation and expression of c-myb protooncogene in cultured rat VSMC treated with platelet-derived growth factor (PDGF). MethodsCell proliferation was determined by cell counting. The expression of c-myb mRNA of VSMC was detected by Northern blot. ResultsAP produced a

6、 dose-dependent inhibition of VSMC proliferation compared with control group. The number of VSMC were (5.45±0.57)×104 (for control group, ±s)； (4.12±0.13)×104, 30 nmol/L； (3.13±0.20)×104, 60 nmol/L; and (2.03±0.05)×104， 120 nmol/L；(q=10.50, 10.32 and 27.0

7、1; P<0.01) respectively. The inhibitory rates were in turn 29%， 52% and 77%, compared with control group. The c-myb mRNA expression of VSMC was also inhibited by AP in a dose-dependent manner. The relative densitometric units were 1.12±0.02 (for control); 0.61±0.01, 30 nmol/L; 0.34±

8、;0.01, 60 nmol/L and 0.16±0.01, 120 nmol/L; (q=39.23, 60.00, and 73.85; P<0.01). ConclusionsAP strongly inhibits both VSMC proliferation and c-myb mRNA expression, suggesting that the mechanism of AP on VSMC proliferation is related to suppressing the late growth regulated gene expression.【K

9、ey words】Smooth muscle cells; Angiopeptin; Oncogene血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖和表型改變是動(dòng)脈粥樣硬化及其他閉塞性血管疾病的主要病理基礎(chǔ)1。血管肽(angiopeptin,AP)系一人工合成環(huán)八肽生長激素釋放抑制因子類似物，對多種細(xì)胞具有抗增殖作用，并能抑制大鼠，家兔，豬和非人靈長類血管內(nèi)皮損傷后肌內(nèi)膜增殖2。其作用機(jī)理尚不完全清楚，一般認(rèn)為與抑制VSMC活化所需生長因子有關(guān)。新近，AP對VSMC增殖基因表達(dá)的影響受到學(xué)者們關(guān)注。有證據(jù)表明，AP能抑制損傷家兔動(dòng)脈c-fos和c-jun的表達(dá)。迄今，AP對c-myb mRNA表達(dá)的作用尚少報(bào)

10、道。為此，我們探討了AP對血小板源性生長因子(PDGF)刺激的體外大鼠胸主動(dòng)脈VSMC表達(dá)c-myb mRNA的作用，從分子生物學(xué)角度研究AP抗細(xì)胞增殖的作用機(jī)理。材料與方法一、細(xì)胞培養(yǎng)選用6周齡雄性SD大鼠活殺，取胸主動(dòng)脈中膜以貼塊法培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FCS,GIBCO產(chǎn)品)，20 mmol/L HEPES(Sigma產(chǎn)品)，2 mmol/L L-谷氨酸，100 IU/ml青霉素，100 g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱(37)培養(yǎng)。待細(xì)胞半融合后以0.01%胰蛋白酶消化傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。二、細(xì)胞增殖抑制分析單細(xì)胞懸液種植于含2.5%FCS-DMEM 24孔培養(yǎng)

11、板中(5×103細(xì)胞/孔)，24 h后換含PDGF及不同劑量AP(HBI-USA惠贈(zèng))的2.5%FCS-DMEM培養(yǎng)基，每劑量組4孔。對照組以PBS代替AP。于第4日行酶消化懸浮細(xì)胞，以計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每孔重復(fù)4次，以均值行統(tǒng)計(jì)分析。三、c-myb mRNA表達(dá)分析1.細(xì)胞同步與AP應(yīng)用：VSMC種植于含2.5%FCS-DMEM的150 mm組織培養(yǎng)皿中(Falcon Labware產(chǎn)品)，每皿9×105細(xì)胞。采用血清饑餓法同步細(xì)胞，即4 h后換0.1%FCS-DMEM。4日后換2.5%FCS-DMEM。換液前1 h,各皿分別加入AP(30,60和120 nmol/L)

12、與PDGF(30 ng/mL)。每2 h補(bǔ)加等量AP一次，14 h收獲細(xì)胞。對照組以等量PBS代替AP。2.RNA提取與Northern印跡，雜交：采用異硫氰酸胍一步法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量，行1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，每泳道上樣20 g,按標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)于尼龍膜(GIBCO產(chǎn)品)。以隨機(jī)引物法標(biāo)記v-myb,GAPDH探針，所用試劑盒為Promega產(chǎn)品。10%硫酸葡聚糖，40%甲酰胺，42雜交16 h,標(biāo)準(zhǔn)SSC洗膜，于-70行放射自顯影。進(jìn)行光密度掃描分析。四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析資料以±s表示，行Newman-Keuls檢驗(yàn)分析。結(jié)果一、AP對VSMC增殖的抑制作用觀察了不

13、同劑量AP對PDGF刺激下VSMC增殖的抑制作用。結(jié)果表明，AP能顯著抑制VSMC增殖，作用呈劑量依賴性。抑制率分別為29%(30 nmol/L),52%(60 nmol/L)和77%(120 nmol/L)(1)。高劑量時(shí)(120 nmol/L)細(xì)胞依然鋪展，未見細(xì)胞死亡，表明細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。二、AP對VSMC c-myb mRNA表達(dá)的影響為探討AP抗增殖作用的分子生物學(xué)機(jī)制，本研究觀察了AP對VSMC c-myb mRNA表達(dá)的作用。結(jié)果表明，AP能明顯抑制VSMC c-myb mRNA的表達(dá)，作用呈劑量依賴性(表1，2)。提示，AP對VSMC增殖的抑制作用至少部分與阻遏c-myb原癌

14、基因表達(dá)有關(guān)。表1AP對培養(yǎng)VSMC c-myb mRNA表達(dá)的作用(±s)分組mRNAGAPDHmrNA/GAPDH對照組29.3±80.51*26.27±0.06*1.12±0.02*AP1組(30 nmol/L)16.0±50.0626.40±0.110.61±0.01AP2組(60 nmol/L)8.94±0.0726.37±0.090.34±0.01AP3組(120 nmol/L)4.09±0.1226.34±0.130.16±0.01*與其他組比較P&l

15、t;0.01，*與其他組比較P>0.05 討論AP為生長激素釋放抑制因子樣肽類家系成員之一，晚近被開發(fā)用作防止肌內(nèi)膜增殖的新制劑3。最初發(fā)現(xiàn)AP能抑制淋巴細(xì)胞增生，推測其具有免疫抑制功能。隨后研究證實(shí)AP對多種腫瘤細(xì)胞也有同樣效應(yīng)。新近，其抗增殖作用已擴(kuò)展至抑制VSMC增殖和動(dòng)脈外植塊的3H摻入4。其抗增殖作用機(jī)理尚不清楚，推測AP與細(xì)胞表面受體結(jié)合能產(chǎn)生抑制信號(hào)或阻止G1期中期關(guān)鍵絲裂原衍生信號(hào)的正常傳號(hào)。AP能進(jìn)入VSMC，有可能防止諸如胰島素樣生長因子-1,表皮生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子的合成與釋放。AP能減少生長因子受體表達(dá)，如血管緊張素,后者為VSMC增生，肥大的促進(jìn)物及PD

16、GF的協(xié)同劑。最近發(fā)現(xiàn)，AP尚能減少VSMC表面血管緊張素受體5。AP抑制早期即刻反應(yīng)原癌基因如c-fos,c-jun的表達(dá)，它們編碼與生長因子有關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，促進(jìn)導(dǎo)致肌內(nèi)膜肥厚的VSMC增殖與細(xì)胞外基質(zhì)分泌。AP也可能通過上調(diào)受體而增加生長因子表達(dá)。c-myb原癌基因同源于禽類髓母細(xì)胞瘤病毒轉(zhuǎn)化基因，在細(xì)胞分化增殖中起關(guān)鍵作用6。本研究AP對PDGF刺激下大鼠離體培養(yǎng)VSMC c-myb mRNA表達(dá)的作用。結(jié)果表明，AP顯著抑制PDGF刺激的VSMC增殖，作用呈劑量依賴性。AP對VSMC c-myb mRNA表達(dá)也具有同樣效應(yīng)。提示，AP可能通過抑制G1期中期關(guān)鍵mRNA產(chǎn)生而發(fā)揮其抗增

17、殖作用。如果受抑mRNA系隨后細(xì)胞周期演進(jìn)所必需，那么G1期中期相應(yīng)基因表達(dá)不足就可能導(dǎo)致細(xì)胞生長受抑。(本文編輯:常青)本課題為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目郗永安（天壇醫(yī)院CCU工作）汪麗蕙（北京大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科100034）唐朝樞（北京大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科100034）參考文獻(xiàn)1，Miano JM, Tota RR, Viasic N, et al. Early protooncogene expression in rat aortic smooth muscle cells following endothelial removal. Am J Pathol, 1990,137:761-7

18、65.2，Santoian EC, Schneider JE, Gravanis MB, et al. Angiopeptin inhibits intimal hyperplasia after angioplasty in porcine coronary arteries. Circulation, 1993,88:11-14.3，Howell MH, Adams MM, Wolfe MS, et al. Angiopeptin inhibition of myointimal hyperplasia after balloon angioplasty of large arteries in hypercholesterolaemic rabbits. Clinical Science, 1993,85:183-188.4，F(xiàn)oegh ML, Asotra S, Conte JV, et al. Early inhibition of myointimal proliferation by angiopeptin after balloon catheter injury in the rabbits. J Vasc Surge, 1994,10:1084-1091.5，Diglio CA