非接觸式共培養(yǎng)技術(shù)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的初步應(yīng)用

1、    非接觸式共培養(yǎng)技術(shù)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的初步應(yīng)用            作者：時(shí)間：2007-11-22 14:50:00                           

2、             作者：趙學(xué)銘，劉易欣，倪春生，趙秀蘭，孫 濤，古強(qiáng)，孫保存 【關(guān)鍵詞】  ,間充質(zhì)干細(xì)胞；惡性黑色素瘤；非接觸式共培養(yǎng),    摘要  目的  研究與惡性黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行非接觸式共培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞表型變化，從而明確非接觸式共培養(yǎng)體系可以應(yīng)用于兩種細(xì)胞之間相互作用的研究。        方法  利用Transwell進(jìn)行非

3、接觸式共培養(yǎng)，分析間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)變化，利用免疫組織化學(xué)與免疫熒光檢測(cè)其因子和CD34表達(dá)。        結(jié)果  間充質(zhì)干細(xì)胞在非接觸式共培養(yǎng)體系中可以被惡性黑色素瘤細(xì)胞誘導(dǎo)為多角形或短梭形，同時(shí)因子和CD34表達(dá)上調(diào)。        結(jié)論  初步表明與惡性黑色素瘤細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞中部分細(xì)胞表型發(fā)生改變，明確非接觸式共培養(yǎng)體系可以應(yīng)用于MSC和惡性黑色素瘤細(xì)胞之間相互作用的研究。      

4、;  關(guān)鍵詞  間充質(zhì)干細(xì)胞；惡性黑色素瘤；非接觸式共培養(yǎng)               Primary application of in vitro cell research by indirect coculture system              Abstract  Objective  To

5、 study the phenotype change and interactions of mouse bone marrowderived mesenchymal stem cells induced by B16, a mouse malignant melanoma cell line.        Methods  Indirect coculture was based on transwell system to analyse the phenotype change of MSC. Determinat

6、ion of the expression of  factors and CD34 by immunohistochemistry and immunofluorescence.        Results  MSC was form in polygon and fusiform induced by B16. Then the immunohistochemistry and immunofluorescence staining show factors and CD34 was upregulation

7、 of MSC.         Conclusion  The results of the indirect coculture experiments with B16 cell and MSC in vitro can initially confirm that parts of the MSC transform their phenotype, it means that indirect coculture system may used in cell interaction research in vit

8、ro.        Key words  mesenchymal stem cells; malignant melanoma; indirect cocuuture               間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSC）是指存在于骨髓基質(zhì)中的非造血組織的另一類重要的干細(xì)胞，它最顯著的生物學(xué)特征是既有自我更新的能力，又具有向多種中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞分

9、化的潛能1,2。它有著廣泛的來源，包括骨髓、骨骼肌、軟骨、骨、肌腱等，故在干細(xì)胞研究領(lǐng)域中具有突出的優(yōu)勢(shì)及非常重要的理論研究意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。        筆者希望通過進(jìn)行MSC細(xì)胞和惡性黑色素瘤細(xì)胞的非接觸式共培養(yǎng)，觀察不同培養(yǎng)條件下的MSC形態(tài)，檢測(cè)多種指標(biāo)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果、分析差異，初步表明與惡性黑色素瘤細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)的MSC中部分細(xì)胞表型發(fā)生改變，明確非接觸式共培養(yǎng)體系可以應(yīng)用于MSC和惡性黑色素瘤細(xì)胞之間相互作用的研究。        1  材

10、料與方法        2  實(shí)驗(yàn)結(jié)果        實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照組可見有大量緊密貼壁生長的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞形態(tài)主要表現(xiàn)為梭形細(xì)胞，胞核呈卵圓形，細(xì)胞形態(tài)較一致，為成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，呈較典型的MSC形態(tài)。非接觸式共培養(yǎng)組部分MSC細(xì)胞光鏡下為成纖維細(xì)胞樣形態(tài)；部分細(xì)胞為多角形或短梭形，邊界清晰，大小較均勻，胞核圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，見圖1和圖2。        

11、60;     非接觸式共培養(yǎng)體系中B16細(xì)胞對(duì)MSC細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)對(duì)比觀察單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照組（表1）與非接觸式共培養(yǎng)組（表2）中96孔MSC細(xì)胞IHC和免疫熒光結(jié)果，呈現(xiàn)單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照組CD34陰性（陽性率4.8%），因子陰性（陽性率5.5%）；呈現(xiàn)非接觸式共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組CD34陽性（陽性率50.9%），因子陽性（陽性率42.2%），見圖36。并應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行2檢驗(yàn)分析共培養(yǎng)組與對(duì)照組在CD34和因子這2個(gè)指標(biāo)間平均陽性細(xì)胞數(shù)的差別（表3），結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在CD34和因子這2個(gè)指標(biāo)上差異有非常顯著性（P<0.01）。

12、60;       表1  單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照組MSC細(xì)胞兩種檢測(cè)指標(biāo)  略     表2  非接觸式共培養(yǎng)組MSC細(xì)胞兩種檢測(cè)指標(biāo)  略    表3  共培養(yǎng)組與對(duì)照組MSC細(xì)胞兩種檢測(cè)指標(biāo)表達(dá)差異略        圖1  圖6  略        3  討論   

13、;     本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞緊密貼壁生長，形態(tài)較均一，其形態(tài)特征基本上為梭形的成纖維細(xì)胞狀，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)3。細(xì)胞CD34及因子陰性，排除了造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的可能性4,5。綜合分析上述結(jié)果證明本次實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組培養(yǎng)的細(xì)胞符合小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)，是未產(chǎn)生分化小鼠骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞。        血管內(nèi)皮是指血管內(nèi)壁覆蓋的一層上皮細(xì)胞，具有許多重要標(biāo)志，主要包括：因子關(guān)聯(lián)抗原（von willebrand factor，vWF），可以由全身所有血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，檢測(cè)這一因子主要

14、用相應(yīng)的抗體。vWF具有很高的特異性，通常認(rèn)為它是反映內(nèi)皮細(xì)胞的最好指標(biāo)6，如人的vWF抗體對(duì)牛的內(nèi)皮細(xì)胞沒有交叉反應(yīng)。        本次實(shí)驗(yàn)中非接觸式共培養(yǎng)組中MSC細(xì)胞光鏡下    部分細(xì)胞為多角形或短梭形；IHC和免疫熒光結(jié)果呈現(xiàn)CD34陽性，因子陽性，并且通過統(tǒng)計(jì)分析得到共培養(yǎng)組與對(duì)照組在CD34和因子2個(gè)指標(biāo)上差異均有非常顯著性（P<0.01）。以上結(jié)果初步證實(shí)與B16非接觸式共培養(yǎng)的MSC部分細(xì)胞發(fā)生向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。     

15、60;  此次實(shí)驗(yàn)采用了非接觸式共培養(yǎng)7，此種培養(yǎng)體系排除了以往接觸式共培養(yǎng)的細(xì)胞混雜不利于后期觀察和區(qū)分結(jié)果的弊端，細(xì)胞分類明確，變化一目了然。而且當(dāng)培養(yǎng)體系中細(xì)胞間相互作用需要通過建立細(xì)胞間緊密連接和（或）需要采用旁分泌的作用方式時(shí)，則不會(huì)引起靶細(xì)胞變化。根據(jù)非接觸式共培養(yǎng)體系的特點(diǎn)，可以進(jìn)一步推測(cè)B16細(xì)胞是否通過向共同培養(yǎng)體系中分泌較高含量的某種或某些細(xì)胞因子對(duì)MSC產(chǎn)生作用，導(dǎo)致MSC的分化。        綜上所述，本研究通過體外進(jìn)行的非接觸式共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，初步表明與惡性黑色素瘤細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)的MSC中部分細(xì)胞

16、表型發(fā)生改變，明確非接觸式共培養(yǎng)體系可以應(yīng)用于兩種細(xì)胞間相互作用及作用方式的研究。雖然，本研究還無法說明B16誘導(dǎo)MSC分化的具體方式以及確切機(jī)制，但是筆者認(rèn)識(shí)了MSC在血管形成中的作用，以及非接觸式共培養(yǎng)體系在研究細(xì)胞間相互作用及作用方式的重要作用。        參考文獻(xiàn)        1 Minguell JJ, Erices A, Conget P.Mesenchymal stem cells. Exp Biol Med，2001，226（6）:507-520.

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