高致病性禽流感病毒廣譜嵌合抗體的構(gòu)建表達(dá)及活性研究.docx

1、Vol.49No.6Nov.2010廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)高致病性禽流感病毒廣譜嵌合抗體的構(gòu)建表達(dá)及活性研究夏琳口，羅文新】，吳君劉彥寧】，傅雅娟。陳毅歆】，陳鴻霖。金鑫2,夏寧邵I(1.廈門大學(xué)國家傳染病診斷試劑及疫苗工程技術(shù)研究中心，生命科學(xué)學(xué)院,2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院.福建廈門361005)摘要：高致病性禽流感病毒高度變異且缺乏有效的治療藥物.在前期研究工作中.本課題組發(fā)現(xiàn)一株隊(duì)源廣譜中和單抗13D4.在動物實(shí)驗(yàn)中顯示出對H5N1禽流感病毒具有廣譜治療效果.在本研究中，從分泌13D4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株

2、中抽提總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出輕重鏈可變區(qū)DNA序列.并分別與人IgGl的輕訊鏈恒定區(qū)基因序列拼接，構(gòu)建人-鼠嵌合抗體.篩選出穩(wěn)定表達(dá)嵌合抗體的CHO細(xì)胞株.從培養(yǎng)上清中純化出嵌合抗體.競爭Elisa結(jié)果表明，嵌合抗體與鼠源單抗能夠識別同一個(gè)抗原表位并具有相似的親和力.血凝抑制反應(yīng)和中和活性測定結(jié)果證明，13D4嵌合抗體保解了對不同亞型H5N1的毒的廣譜反應(yīng)性.并且對兩株H5N1的毒具有中和活性.本研究獲得的131)4嵌合抗體將具有潛在的治療價(jià)值.關(guān)鋌詞:H5N1,嵌合抗體;廣譜活性中圖分類號:Q511文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0438-0479(2010)06-0845-05大部分禽流感

3、病毒只會引起人體的微弱感染，1997年首次在香港出現(xiàn)的高致病性禽流感H5N1病毒則例外，它具有顯著的廣譜宿主范圍，在小型大型貓科、嚙齒類、靈長類動物等許多野生動物及家禽中引起致命性疾病.H5N1病毒的持續(xù)感染使人類感染致死率超過了60%.M2離子通道抑制劑與神經(jīng)氛酸酶抑制劑為病毒有效的預(yù)防制劑，但并不能作為有效的治療藥物E.由于抗體介導(dǎo)的主動免疫反應(yīng)能夠阻擋病毒與靶細(xì)胞結(jié)合而成為感染的治療方法之一.1918年“西班牙流感”中輸入康復(fù)病人的血清減少了50%的致死率，近來嚴(yán)重的H5N1病人從康復(fù)者的血清中也成功獲得了免疫能力.已有報(bào)道證明鼠源及人源單克隆抗體對H5N1病毒感染前后的動物具有保護(hù)效果

4、.針對病毒的高度變異性，篩選特異識別H5N1病毒抗原保守表位的廣譜交叉中和性單克隆抗體成為收2010-04-29基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目(30901077),教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)頊目(108157),國家傳染病S：大專項(xiàng)(2008ZX10004-006),福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2008Y0059,2009YZ0002)通訊作者:wxluo研究者們的目標(biāo)”)，并試圖將該類單抗人源化后用于人類的感染治療，避免鼠源單抗的免疫原性帶來的副作用回我們已報(bào)道了一組廣譜交叉反應(yīng)的H5特異性抗體，其中13D4為最有效的鼠源保護(hù)性抗體.動物實(shí)驗(yàn)證實(shí),13D4鼠單抗對4個(gè)H5N1禽流感病毒代表亞

5、型1,2.1,2.2,2.3的感染均具有良好的治療效果本研究中，我們將構(gòu)建表達(dá)13D4嵌合抗體，旨在大幅度減弱鼠源單抗的免疫原性、延長抗體在體內(nèi)的半衰期，為治療性抗體的研究和抵御高致病性禽流感H5N1對人類的危害奠定基礎(chǔ).1材料與方法1.1材料本研究中所用的大腸桿菌DH5a為實(shí)驗(yàn)室保存；真核表達(dá)載體pcDNA5/FRT/TO、定點(diǎn)真核表達(dá)系統(tǒng)Flp-In及表達(dá)細(xì)胞株Flp-InCHO購自Invitrogen公司3轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofect2000、篩選試劑潮源素購自Invitrogen公司；各種限制性內(nèi)切酶、LA-TaqDNA聚合酶、T4連接酶、pMD18-T載體均購自大連TaKaRa公司；無

6、血清SFM4培養(yǎng)基購自Hyclone公司；滅活H5N1病毒株由香港大學(xué)新發(fā)傳染病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；13D4鼠單抗，HRP標(biāo)記的13D4鼠單抗，抗HBVpreSl的4D11嵌合抗體.proteinA和重組HA1由本實(shí)驗(yàn)室研制及純化.1.2方法1.2.113D4鼠單抗可變區(qū)基因的克隆從13D4雜交瘤細(xì)胞株中抽提總mRNA,oligodT引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA（PromegaMadisonWI）.根據(jù)Novagen公司Ig-Prime試劑盒的引物序列合成31條上游引物和4條下游引物，以cDNA為PCR擴(kuò)增的模板，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PMD18-T載體中，測序并分析以確定分離出抗體可變區(qū)基因.1.2.2嵌合

7、抗體表達(dá)載體的構(gòu)建在pcDNA5/FRT/TO定點(diǎn)整合載體基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，形成一個(gè)帶有兩個(gè)pCMV啟動克隆位點(diǎn)及BGH終止子的真核表達(dá)載體pcDNA5/FRT/PJ241.利用DNA重組技術(shù)，將人gamma重鏈恒定區(qū)及人kappa輕鏈恒定區(qū)，分別插入兩個(gè)pCMV啟動子的下游.將13D4VH基因經(jīng)HindIII和KpnI雙酶切插入重鏈恒定區(qū)上游，再將13D4VK基因經(jīng)BamHI和EcoRV雙酶切插入輕鏈恒定區(qū)的上游.經(jīng)測序驗(yàn)證獲得能表達(dá)嵌合抗體的重組質(zhì)粒pcDNA5/FRT/PJ241/13D嵌合抗體在CHO細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)采用Lipofect2000將p（）G44質(zhì)粒（Invit

8、rogen,USA）以及嵌合抗體表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入Flp-InCHO細(xì)胞中.用潮霉素加壓篩選1個(gè)月（終質(zhì)量濃度為600Mg/mL）,獲得穩(wěn)定分泌嵌合抗體的穩(wěn)定細(xì)胞株.1.2.4嵌合抗體的表達(dá)及純化CHO穩(wěn)定細(xì)胞株在體積分?jǐn)?shù)為10%的FBSDMEM培養(yǎng)基中長至3X10。mL-*，再直接換為無血清培養(yǎng)基SFM4培養(yǎng)57d后收集上清.用飽和硫酸鉉初步純化后，再用ProteinA親和層析柱分離純化嵌合抗體，收取特異性蛋白洗脫峰,SDS-PAGE電泳確定純度.1.2.5 ELISA檢測嵌合抗體活性酵母表達(dá)的重組HA1包被96孔板（1Mg/mL）,ED液封閉，純化的13D4嵌合抗體作為一抗與之反應(yīng),再與羊抗

9、鼠酶標(biāo)抗體（體積比為1:2000）反應(yīng)后顯色終止，酶標(biāo)儀讀值.1.2.6 競爭ELISA反應(yīng)3G4抗體（2pg/mL）包被96孔板捕獲H5N1病毒（8HA）后，嵌合抗體以50Mg/mL初始質(zhì)量濃度倍比稀釋后與HRP標(biāo)記的13D4mAb同時(shí)加入孔中競爭結(jié)合病毒.抗HBVpreSl的4D11嵌合抗體用作陰性對照，13D4鼠源單抗作為陽性對照.顯色終止后酶標(biāo)儀讀值.1.2.7 血凝抑制反應(yīng)血凝抑制方法檢測嵌合抗體的廣譜反應(yīng)性.根據(jù)修改后世界衛(wèi)生組織動物流感診斷與監(jiān)督手冊中的操作方法，血凝抑制可得到與H5N1不同亞型的反應(yīng)活性m.所用H5N1病毒均為滅活病毒，測定病毒HAU值，調(diào)至8AD.在血凝板中每

10、孔加入25PBS,第一孔中加25mL嵌合抗體（0.7Mg/mL）并混勻，倍比稀釋至最后一孔，棄25mL.與等體積病毒室溫孵育45min,加入0.75%雞紅細(xì)胞50L,室溫孵育30min,觀察是否出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集以判斷嵌合抗體的血凝抑制效應(yīng).1.2.8細(xì)胞微孔中和實(shí)驗(yàn)梯度稀釋的13D4嵌合抗體與半數(shù)組織培養(yǎng)感染最（TCID50）的H5N1病毒混勻，37C孵育培養(yǎng)2h后，加入MDCK細(xì)胞中，37C,5%（體積分?jǐn)?shù)）CO?培養(yǎng)箱孵育1h,然后吸去上清，用體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72h.取細(xì)胞上清用血凝方法判定中和滴度，血瓶活性呈現(xiàn)陰性孔對應(yīng)的抗體最高稀釋度即為此抗體的中和滴度.該實(shí)驗(yàn)在

11、香港大學(xué)新發(fā)傳染病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的P3實(shí)驗(yàn)室中完成.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.113D4嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)建采用RT-PCR法從分泌13D4鼠單抗的雜交痛細(xì)胞中克隆出抗體可變區(qū)核昔酸序列.測序結(jié)果表明，重鏈可變區(qū)長為369bp,編碼123個(gè)氨基酸，輕鏈可變區(qū)為324bp,編碼108個(gè)氨基酸.本研究運(yùn)用Invitrogen公司的Flp-In定點(diǎn)整合系統(tǒng)來篩選表達(dá)嵌合抗體的CHO細(xì)胞株.該系統(tǒng)在宿主細(xì)胞的染色體高轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)上引入FRT序列，在POG44質(zhì)粒表達(dá)的Flp重組酶作用下，可將目的基因定點(diǎn)整合在FRT位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的定點(diǎn)高表達(dá).對pcDNA5/FRT/TO質(zhì)粒進(jìn)行改造，使其帶有兩個(gè)pCMV啟動

12、的克隆位點(diǎn)及BGHpA終止序列，再將人gamma重鏈恒定區(qū)和人kappa輕鏈恒定區(qū)分別插入兩個(gè)pCMV啟動子的下游，并將13D4的VH片段經(jīng)和VK序列分別克隆到人重鏈和輕鏈恒定區(qū)上游.測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了表達(dá)嵌合抗體的質(zhì)粒PCMVPCMV圖1表達(dá)13D4嵌合抗體的pcDNA5/FRT/PJ241/13D4質(zhì)粒圖Fig.1pcDNA5/FRT/PJ241/13EMplasmidvectorof13EMcAbexpressionpCDNA5/FRT/PJ241/13D4（圖1）.2.2 13D4嵌合抗體的穩(wěn)定表達(dá)及純化將pOG44質(zhì)粒與嵌合抗體表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入Flp-InCHO細(xì)胞中.用潮霉素加

13、壓篩選1個(gè)月后，獲得穩(wěn)定分泌13D4嵌合抗體的穩(wěn)定細(xì)胞株.穩(wěn)定表達(dá)13D4嵌合抗體的CHO細(xì)胞株在10cm細(xì)胞培養(yǎng)板中，用體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至3X106mLT后，培養(yǎng)液更換為SFM4無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，對7d內(nèi)的培養(yǎng)上清進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)量監(jiān)測.由圖2的結(jié)果可知，表達(dá)產(chǎn)量在第4天達(dá)到最高峰為8mg/L,而后逐步降低.推測隨著細(xì)胞的逐漸凋亡，產(chǎn)量下降，同時(shí)培養(yǎng)液中的抗體也被逐漸降解.因此收集第4天的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行純化，經(jīng)ProteinA親和層析后得到純度超過95%的嵌合抗體（圖3）.2.3 13D4嵌合抗體的活性檢測以間接ELISA法檢測經(jīng)梯度稀釋后的純化13D4嵌合抗體與

14、酵母表達(dá)的重組HA1的結(jié)合活性.由圖4的結(jié)果可知,13D4嵌合抗體與雨組HA1的反應(yīng)呈劑量依存性關(guān)系（圖4）.進(jìn)一步用競爭ELSIA法檢測13D4嵌合抗體的活性.H5N1病毒被包被在板上的特異抗體捕獲，以梯度稀釋的13D4嵌合抗體與HRP標(biāo)記的13D4鼠單抗競爭結(jié)合H5N1病毒.以未標(biāo)記的13D4鼠單抗作為陽性對照，抗HBVpreSl的4D11嵌合抗體作為陰性對照.結(jié)果如圖5所示,13D4嵌合抗體及親本13D4鼠單抗的競爭曲線相似，說明二者能有效競爭HRP標(biāo)記的13D4鼠單抗與H5N1病毒的結(jié)合，親和力相01，一一11234567t/d01，一一11234567t/d圖2CHO穩(wěn)定細(xì)胞株在無血

15、清培養(yǎng)基中表達(dá)嵌合抗體的產(chǎn)量變化Fig.2TheproductioncurveofcAbexpressionformCHOstablecelllineinserum-freemediumM!256.251.56250.390625256.251.56250.390625圖413D4嵌合抗體與重組HA1反應(yīng)的劑量依存關(guān)系Fig.4Thedosedependencyof13D4chimericantibodybindingtorecombinantHA1圖313D4嵌合抗體SDS-PAGE電泳結(jié)果M,蛋白Marker；1.還原型；2.非還原型Fig.3SDS-PAGEofpurified13D4c

16、himericantibody似并且有一致的特異結(jié)合表位.2.413D4嵌合抗體的廣譜血凝抑制活性和中和活性測定選取具有代表性的7株H5N1病毒株，分別分布-*-13D4mAb-I3D4cAb-*-4DlIcAb圖5競爭ELISA檢測13D4嵌合抗體與H5N1病毒的特異反應(yīng)Fig.5Thespecificreactionof13D4chimericantibodywithH5N1virusdetectedbycompetitiveELISA在印尼及我國香港、青海等地，是從雞、鴨及數(shù)種野生鳥類中分離所得，通過血凝抑制法來檢測嵌合抗體的廣譜反應(yīng)活性.13D4嵌合抗體與親本鼠單抗均以2mg/mL質(zhì)量

17、濃度進(jìn)行廣譜血凝抑制測定，結(jié)果顯示嵌合抗體與親本鼠抗的廣譜活性基本一致，表明嵌合抗體保留了原鼠單抗的廣譜反應(yīng)活性及親和力（表1）.進(jìn)一步測定13D4嵌合抗體對兩株H5N1病毒的中和活性.結(jié)果顯示13D4嵌合抗體對兩種病毒均有中和活性，且中和滴度與親本鼠單抗相似（表2）.表113D4嵌合抗體對H5N1病毒的廣譜血凝抑制活性測定Tab.1Hemagglutinininhibitionactivityof13D4cAbtoH5N1virusH5N1病毒株病毒分枝】3以嵌合抗體13D4鼠單抗VNM/1194/20041400400CK/IDN/2A/2OO42.164006400BHGS/QH/15/

18、20052.216001600CK/VNM/568/20052.316001600CK/YN/115/20042.41600800A/CK/HK/YU22/20028800800MDK/JX/1653/20059800400表213D4嵌合抗體對H5N1病毒的中和活性測定Tab.2Neutralizingactivityof13D4cAbtoH5N1virusH5N1病毒株病毒分枝13D1嵌合抗體13以鼠單抗SZ/12.11:12801:1280BH/GoosQH/15C/052.21«12801«12803討論血凝素（HA）為病毒表面負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的蛋白，能通過胞

19、吞作用及隨后的膜融合進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)HA為中和抗體的主要靶位因而成為藥物及疫苗研究中重要的抗原表位.由于HA基因的抗原漂移使禽流感病毒持續(xù)突變悠而使其具有種間傳染及在宿主體內(nèi)免疫逃逸的能力口刃.面對禽流感病毒高變異性、發(fā)病癥狀難辯別、任何診斷和治療的延誤都可能導(dǎo)致患者死亡的特點(diǎn)，傳統(tǒng)的疫苗和藥物很難有效解決禽流感疫情的大規(guī)模爆發(fā).近年來，治療性抗體在感染性疾病領(lǐng)域迅猛發(fā)展，在過去的10年中，超過20株抗體藥物通過FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于人類疾病的治療，100多株治療性抗體正在臨床試驗(yàn)中.鼠源性抗體在人類的治療中金產(chǎn)生很多副作用如HAMA反應(yīng)，為了使鼠源單抗能夠用于人的治療，可以對鼠單抗進(jìn)行人源化改造，即將

20、鼠抗體可變區(qū)與人抗體恒定區(qū)相嵌合，不僅能大大降低其免疫原性，保持鼠抗體結(jié)合抗原的特異性及產(chǎn)生人抗體恒定區(qū)Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能，而且也能延長抗體在人體內(nèi)的半衰期.近期，運(yùn)用嵌合抗體成功治療感染H5N1病毒小鼠模型的研究已有報(bào)道購本研究對13D4鼠單抗進(jìn)行人源化改造，構(gòu)建人-鼠嵌合抗體，也為后期更高程度的CDR區(qū)移植打好基礎(chǔ).我們研制的高致病性禽流感病毒廣譜嵌合抗體13D4是將輕、重鏈表達(dá)基因與篩選擴(kuò)增基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，使輕、重鏈能在篩選與表達(dá)中保持均衡擴(kuò)增，所表達(dá)的嵌合抗體能正確折疊并成功分泌至細(xì)胞外.目前CH0細(xì)胞被較多用于表達(dá)抗體分子，也是較成功的表達(dá)體系，它能夠較準(zhǔn)確地完成抗體鏈的

21、裝配、翻譯后修飾、分泌等機(jī)制，產(chǎn)生完整的具備正常效應(yīng)功能的抗體分子s.13D4嵌合抗體在競爭ELISA中與親本抗體識別同一個(gè)抗原表位；在血凝抑制實(shí)驗(yàn)中保持了與H5N1病毒不同亞型的廣譜活性；在中和測定中表現(xiàn)出與親本抗體相似的病毒中和活性.13D4嵌合抗體的成功構(gòu)建將為禽流感病毒抗體治療藥物的研發(fā)提供一種選擇.參考文獻(xiàn)：1 BeareAS,WebsterRG.ReplicationofavianinfluenzavirusesinhumansCJ.ArchVirol»1991119（1/2）：37-42.2 PappaioanouM.HighlypathogenicH5N1aviani

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