肺癌胸水間期細(xì)胞遺傳學(xué)異常變化的研究

1、肺癌胸水間期細(xì)胞遺傳學(xué)異常變化的研究【摘要】目的探討肺癌胸水腫瘤細(xì)胞的間期細(xì)胞遺傳學(xué)改變，并將其結(jié)果與傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)結(jié)果進(jìn)行比較。方法用7號(hào)、11號(hào)、17號(hào)、X染色體著絲粒特異的DNA探針，對(duì)26例肺癌胸水標(biāo)本進(jìn)行雙色熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)。結(jié)果在19例肺癌陽性胸水標(biāo)本中，7號(hào)、X、17號(hào)、11號(hào)染色體出現(xiàn)超二倍體的病例分別為16例(84.2%)、14例(73.7%)、12例(63.2%)、8例(42.1%)。2例可疑癌胸水標(biāo)本7號(hào)、X染色體也均表現(xiàn)為超二倍體。在5例肺癌陰性胸水中，有2例FISH結(jié)果X染色體出現(xiàn)超二倍體改變

2、。其它3例陰性胸水以二倍體細(xì)胞為主。結(jié)論染色體超二倍體改變是肺癌胸水腫瘤細(xì)胞的重要特征，F(xiàn)ISH技術(shù)可以檢測(cè)胸水標(biāo)本中的超二倍體腫瘤細(xì)胞，而且染色體超二倍體改變對(duì)臨床沒有發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤及診斷為可疑癌的病例有一定的提示作用?！娟P(guān)鍵詞】熒光原位雜交；肺癌；胸水；超二倍體 Study on interphase cytogenetic abnormalities in malignant cells in pleural fluids from lung cancer casesJIA Donghui(Department of Cytology, Cancer Institute/Hospital

3、, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100021 P. R. China. E-mail: jiadh)ZHANG Zhihui(Department of Cytology, Cancer Institute/Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100021 P. R. China. E-mail: jiadh)LIU Sufan(Department of Cytology, Cancer Institute/Hospital, Chinese Acade

4、my of Medical Sciences, Beijing, 100021 P. R. China. E-mail: jiadh)CHENG Shujun(Department of Cytology, Cancer Institute/Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100021 P. R. China. E-mail: jiadh)【Abstract】ObjectiveTo study the interphase cytogenetic abnormalities in malignant cells i

5、n pleural fluids from lung cancer cases by fluorescence in situ hybridization(FISH) and compare the result of FISH with that of conventional cytology. MethodsTwenty-six pleural fluids from the lung cancer cases were detected by dual-fluorescence in situ hybridization centromere DNA probes of chromos

6、omes 7, 11, 17, and X. ResultsIn 19 positive pleural fluids the rates of hyperdiploid in chromosomes 7, X, 17 and 11 were 16(84.2%), 14(73.7%), 12(63.2%) and 8(42.1%), respectively. In 2 suspicious malignant pleural fluids, both chromosomes 7 and X showed hyperdiploid. Two cases of hyperplasia from

7、5 negative specimens also showed gain of chromosome X. Another 3 negative pleural fluids had a normal number of chromosome. ConclusionOne of the important abnormalities occurred in tumor cells derived from pleural fluid of lung cancer is hyperdiploid, which can be detected by FISH. Therefore, hyperd

8、iploid in pleural fluid cells can be an implication for the malignancy that has not been detected or confirmed by cytological examination.【Key words】fluorescence in situ hybridization;lung cancer;pleural fluids;hyperdiploid間期細(xì)胞遺傳學(xué)是應(yīng)用染色體特異重復(fù)序列DNA探針結(jié)合原位雜交技術(shù)對(duì)未分裂細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞遺傳學(xué)分析。熒光原位雜交(fluorescence in situ

9、hybridization, FISH)技術(shù)是目前在細(xì)胞水平檢測(cè)染色體數(shù)目異常的有效方法。其優(yōu)點(diǎn)是不必進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和染色體制備來分析染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常。許多研究表明1，2，F(xiàn)ISH技術(shù)可以作為傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)診斷的輔助手段來鑒別正常與腫瘤細(xì)胞。我們利用7號(hào)、X、11號(hào)、17號(hào)染色體著絲粒特異的DNA探針來檢測(cè)肺癌胸水中的超二倍體腫瘤細(xì)胞，并將其結(jié)果與傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)診斷進(jìn)行比較。1材料與方法1.1肺癌胸水標(biāo)本由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院臨床細(xì)胞學(xué)室提供，共26例。每例標(biāo)本均由兩位細(xì)胞學(xué)專家進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷，見表1。分3組：(1)肺癌陽性胸水，共19例(病例119)；(2)肺癌可疑癌胸水，共2例(病例20，21

10、)；(3)肺癌陰性胸水，共5例(病例2226)。1.2探針、標(biāo)記及檢測(cè)試劑，見表2。1.3標(biāo)本制備離心胸水收獲細(xì)胞；加入37 預(yù)溫的低滲液(0.075 mol/L KCl)，37 低滲20 min，然后加入固定液(31甲醇乙酸)預(yù)固定(固定液終濃度：體積分?jǐn)?shù)為10%)，離心棄上清。加入上述固定液室溫固定20 min，離心棄上清，重復(fù)2次。用少量固定液重懸細(xì)胞，滴在已涂有多聚賴氨酸的載玻片上，自然干燥。表126例肺癌胸水染色體數(shù)目變化結(jié)果Table 1 The result of numerical chromosomal abnormality in 26 cases of pleural f

11、luids from lung cancerCase(病例)Cytologic diagnosis(細(xì)胞學(xué)診斷)Sex(性別)Chromosomes(染色體)71117X1AdenocarcinomaM+-+2AdenocarcinomaM+0+3AdenocarcinomaM+/-+4Alveolar cell carcinomaF+00+5AdenocarcinomaF+6Cancer cellsM+-0-7Considered squamousM+cell carcinoma8AdenocarcinomaF+0+/-+9ConsideredF+0adenocarcinoma10Cance

12、r cellsM+0+11Malignant cellsF-+-+12Malignant cellsF+0+13Malignant cellsM+-+14AdenocarcinomaF+00015AdenocarcinomaF+16ConsideredM-+-adenocarcinoma17Cancer cellsM000018AdenocarcinomaM+-0+19Cancer cellsM+0+20Suspicious cancer cellsM+21Suspicious cancer cellsF+22No cancer cellsF0-023Mesothelial hyperplas

13、iaF+24No cancer cellsM000025Mesothelial hyperplasiaM000026Considered tuberculosisM0000+:hyperdiploid(超二倍體)；-：hypodiploid(低二倍體)；0：diploid(二倍體)；M:male(男)；F:female(女)；adenocarcinoma(腺癌)；squamous cell carcinoma(鱗癌)；alveolar cell carcinoma(肺泡細(xì)胞癌)；considered squamous cell carcinoma(考慮鱗癌)；considered adenoc

14、arcinoma(考慮腺癌);cancer cells(癌細(xì)胞)；malignant cells(惡性細(xì)胞)；suspicious cancer cells(可疑癌細(xì)胞)；no cancer cells(未見癌細(xì)胞)；mesothelial hyperplasia(間皮細(xì)胞增生)；considered tuberculosis(考慮結(jié)核) 1.4雜交探針雜交液混合物配制雜交前將標(biāo)記好的探針用雜交液(體積分?jǐn)?shù)為55%甲酰胺，1SSC，10 g/L硫酸葡聚糖，1 g/L鮭魚精DNA)配成210-5 g/L的雜交混合物。探針變性：配好的探針雜交液混合物于75 水浴變性10 min，然后立即入冰。雜交

15、前標(biāo)本的處理：70%乙酸處理10 min，PBS洗5 min3次。乙醇梯度脫水，風(fēng)干。70%甲酰胺-2SSC中75變性4 min，立即放入70%，90%，100%乙醇脫水各3 min，風(fēng)干。雜交：將變性過的探針加到上述變性的標(biāo)本上，Rubber Solution封片，置溫盒中于37 雜交過夜。雜交后洗滌：雜交完畢后，片子在42 的50%甲酰胺-2SSC中洗5 min3次，2SSC中洗5 min3次。檢測(cè)：室溫下在4SSCT(4SSC 0.1%Tween 20)中洗3 min。加4SSCB(4SSCB-0.5 g/L Blocking Reagent-0.02 g/L NaN3 Boehring

16、er Mannheim, Germany)室溫封閉20 min。加Avidin-FITC(510-3 g/L-4SSCB Vector Laboratories Inc., USA)室溫封閉20 min。置溫盒中于37 孵育40 min。4SSCT洗5 min3次。加Biotinylated goat anti-avidin抗體(510-3 g/L-4SSCB Vector Laboratories, USA)置溫盒中于37 孵育40 min。4SSCT洗5 min3次。加Avidin-FITC(510-3 g/L-4SSCB)與Anti-Digoxigenin Rhodamine(210-2

17、 g/L Boehringer Mannheim, Germany)的混合液，置溫盒中于37孵育40 min。4SSCT洗5 min3次。梯度乙醇脫水，風(fēng)干。加DAPI復(fù)染。1.5對(duì)照研究上述4種人染色體特異探針與6名健康人(其中男性3名、女性3名)的外周血細(xì)胞中期分裂染色體雜交，以確證各探針雜交的特異性，并計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞中具有1個(gè)雜交信號(hào)，以及3個(gè)雜交信號(hào)的細(xì)胞比例，用以計(jì)算每個(gè)探針具有1個(gè)雜交信號(hào)和3個(gè)雜交信號(hào)的細(xì)胞的99%可信限(上限)作為判定標(biāo)本中異倍體的標(biāo)準(zhǔn)。我們選擇具有某一異常數(shù)目的細(xì)胞所占的比例10%作為判定異倍體的標(biāo)準(zhǔn)。之所以選擇10%是因?yàn)樵趯?duì)照研究中具有異常雜交信號(hào)的比例

18、細(xì)胞計(jì)算出的99%的可信限遠(yuǎn)小于10%。這一標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)3中判定異倍體的標(biāo)準(zhǔn)是一致的。1.6質(zhì)量控制每一批雜交實(shí)驗(yàn)都帶一張正常血細(xì)胞的染色體片。若雜交后，正常染色體片中各探針具有2個(gè)雜交信號(hào)(男性中X染色體為一個(gè)信號(hào))的比例明顯低于對(duì)照研究中的平均比例，或雜交信號(hào)很弱，難以辨別，則視該次雜交失敗，棄之重新雜交。表2雙色FISH中染色體DNA探針的標(biāo)記和檢測(cè)Table 2 Labelling and detection of chromosomal centrometric DNA in the dual-color FISHGroup(組別)Chromosome(染色體)Labelled rea

19、gents(標(biāo)記試劑)Detected reagents(檢測(cè)試劑)Signal colors(信號(hào)顏色)A17Digoxigenin-11-dUTPAnti-digoxigenin-RhodanmineRed11Biotin-16-dUTPAvidin-FITCGreenBXDigoxigenin-11-dUTPAnti-digoxigenin-RhodamineRed7Biotin-16-dUTPAvidin-FITCGreenRed(紅色)；Green(綠色)；Digoxigenin-11-dUTP(地高辛-11-尿嘧啶核苷酸)；Anti-digoxigenin-Rhodanmine(羅

20、丹明標(biāo)記的抗地高辛抗體)；Biotin-16-dUTP(生物素-16-尿嘧啶核苷酸)；Avidin-FITC(親和素-熒光素異硫氰酸鹽) 1.7鏡下觀察并計(jì)數(shù)雜交后用Nikon熒光顯微鏡配以FITC/TEXAS RED/DAPI三色濾光片觀察結(jié)果，用ECTASCHROME400ASA彩色負(fù)片攝影記錄。雜交信號(hào)的判定參照Hoppman等4的標(biāo)準(zhǔn)，每一個(gè)標(biāo)本在計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞中兩探針具有的雜交信號(hào)的數(shù)目，并計(jì)算其占總計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比。破損、重疊、邊界不清、具有明顯非特異性雜交背景和信號(hào)模糊不清的細(xì)胞不計(jì)在內(nèi)。相差一個(gè)信號(hào)間距兩點(diǎn)判斷為2個(gè)信號(hào)。2結(jié)果4個(gè)染色體探針在26例肺癌胸水標(biāo)本中的雜交結(jié)果，

21、見表1。在19例肺癌陽性胸水標(biāo)本中，7號(hào)、X染色體出現(xiàn)超二倍體的病例分別為16例(84.2%)、14例(73.7%)，17號(hào)、11號(hào)染色體超二倍體的標(biāo)本也占有相當(dāng)高的比例，分別達(dá)到12例(63.2%)、8例(42.1%)，此結(jié)果說明染色體超二倍體改變?cè)谀[瘤中是一種常見現(xiàn)象(1)。但病例17中4個(gè)染色體拷貝數(shù)均未出現(xiàn)改變。2例可疑癌胸水標(biāo)本(病例20、21)也均表現(xiàn)為7號(hào)、X染色體超二倍體。在5例陰性胸水中，有2例(病例23、25)細(xì)胞學(xué)診斷為間皮細(xì)胞增生，病例23原位雜交結(jié)果7號(hào)、X染色體出現(xiàn)超二倍體改變，經(jīng)復(fù)查后，發(fā)現(xiàn)此病例為腺癌(2)，其先前肺癌術(shù)后病理結(jié)果也為腺癌。病例25原位雜交結(jié)果只

22、有X染色體表現(xiàn)超二倍體改變，復(fù)查后，發(fā)現(xiàn)有1個(gè)可疑癌細(xì)胞，支氣管鏡活檢結(jié)果：見有少許破碎的鱗癌細(xì)胞。其它3例陰性胸水超二倍體的細(xì)胞不超過10%(3)。由此可以看出FISH結(jié)果與細(xì)胞學(xué)結(jié)果不僅具有高度的一致性，而且對(duì)于細(xì)胞學(xué)沒有發(fā)現(xiàn)的惡性病例及診斷為可疑癌的病例給予一定的提示作用。1肺腺癌胸水標(biāo)本7號(hào)(綠)，X(紅)染色體雙色熒光原位雜交，染色體超二倍體15002肺癌胸水標(biāo)本原診斷為間皮細(xì)胞增生，經(jīng)復(fù)查后診斷為腺癌，雙色熒光原位雜交，11號(hào)染色體(綠)二倍體，17號(hào)染色體(紅)超二倍體15003陰性胸水標(biāo)本11號(hào)(綠)，17號(hào)(紅)染色體雙色熒光原位雜交，染色體二倍體1500Fig 1 Pleu

23、ral fluids from the lung adenocarcinoma detected by dual-FISH chromosomes 7 (green) and X(red) showed hyperdiploid.1500Fig 2 Pleural fluids from the lung cancer detected by dual-FISH Chromosomes 11(green) and 17(red) were diploid and hyperdiploid, respectively. Their previous cytologic diagnosis was

24、 hyperplasia. Then they were reexaminated and diagnosed as adenocarcinoma.1500Fig 3 Negative pleural fluids detected by dual-FISH Chromosomes 11(green) and 17(red) were diploid.15003討論在19例肺癌陽性胸水標(biāo)本中4個(gè)染色體拷貝數(shù)都表現(xiàn)不同程度的增加，說明胸水中腫瘤細(xì)胞具有多個(gè)克隆。7號(hào)、X染色體出現(xiàn)超二倍體的比例最高分別為84.2%(16/19)、73.7%(14/19)。從結(jié)果百分比可以看出，F(xiàn)ISH結(jié)果與細(xì)胞學(xué)

25、結(jié)果具有很好的一致性，可以進(jìn)一步確證細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果。病例17中4個(gè)染色體拷貝數(shù)均未出現(xiàn)改變，但這并不能排除其他染色體出現(xiàn)超二倍體改變。2例可疑癌的胸水標(biāo)本4個(gè)染色體也均表現(xiàn)超二倍體。在5例陰性胸水中，有2例(病例23，25)細(xì)胞學(xué)診斷為間皮細(xì)胞增生，病例23原位雜交結(jié)果7號(hào)、X、17號(hào)、11號(hào)染色體均出現(xiàn)明顯超二倍體改變，具有超二倍體的細(xì)胞比例達(dá)到30%50%。經(jīng)復(fù)查，發(fā)現(xiàn)病例23為腺癌，先前肺癌術(shù)后病理結(jié)果也為腺癌。病例25原位雜交結(jié)果X染色體出現(xiàn)超二倍體改變的細(xì)胞比例是10.8%，而其他3個(gè)染色體以二倍體為主，復(fù)查后，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)可疑癌細(xì)胞，它的支氣管鏡活檢有少許破碎的鱗癌細(xì)胞。其它3例陰性

26、胸水超二倍體的細(xì)胞不超過10%。對(duì)于這2例細(xì)胞學(xué)漏診的陽性病例，可能由于胸水中含有大量的良性細(xì)胞，而腫瘤細(xì)胞的數(shù)量較少。這種情況下，腫瘤細(xì)胞很容易被閱片人漏掉。我們的結(jié)果表明，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測(cè)染色體超二倍體改變，對(duì)于細(xì)胞學(xué)沒有發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤及診斷為可疑癌的病例給予一定的提示作用。Chen等7與Cajulis等8的研究也支持本室驗(yàn)結(jié)果?？傊?，染色體超二倍體改變是肺癌胸水腫瘤細(xì)胞的主要特征，熒光原位雜交技術(shù)可以檢測(cè)胸水標(biāo)本中的超二倍體腫瘤細(xì)胞，而且染色體超二倍體改變對(duì)臨床沒有發(fā)現(xiàn)的惡性及診斷為可疑癌的病例可有一定的提示作用。作者單位：賈東輝（100021 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院臨床細(xì)胞學(xué)室）

27、張智慧（100021 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院臨床細(xì)胞學(xué)室）劉樹范（100021 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院臨床細(xì)胞學(xué)室）程書鈞（100021 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院臨床細(xì)胞學(xué)室）參考文獻(xiàn)1，Wolman SR. Application of fluorescence in situ hybridization techniques in cytopathology. Cancer Cytopathol, 1998, 84193-197.2，Abati A, Sanford JS, Fertsch P, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): a userguide to optimal preparation of cytologic specimens. Diagn Cytopathol, 1995, 13486-492.3，Veltman JA, Hopman ANH, Bot FJ, et al. Detection of c