流式細胞術(shù)在血小板檢測中的應(yīng)用于方法介紹 - 圖文-

1、 Flow Cytometry June 2000 · · · 一次性 12´75 mm Falcon 試管。 微量加樣器和加樣頭。 BD 抗體：2-8°C 保存。 熒光抗體 對照管 試驗管 FITC PAC-1+RGDS PAC-1 PE IgG1 CD62P PerCP CD61 CD61 · · RGDS (PAC-1 阻斷劑：用 PBS 配制，10mg/ml。 血小板激活劑：ADP，濃度 2´10 M，2-8°C 保存。也可選用其他激活劑， 如 PMA、纖維蛋白、TRAP。 -4 · &

2、#183; · · · · PBS 緩沖液：含 0.1%NaN3，過濾后 2-8°C 保存。 固定液：含 1%多聚甲醛的 PBS 緩沖液，2-8°C 可保存一周。 振蕩混勻器。 FACS 流式細胞儀：進行數(shù)據(jù)獲取。 CaliBRITE Beads/FACSComp 軟件：FACS 儀器校正，預(yù)設(shè)獲取條件。 CellQuest 軟件：試驗數(shù)據(jù)獲取和分析軟件。 操作步驟 1. 標本采集： (1 采血管順序編號。 (2 抽取靜脈血，采血管中注入 2ml。 (3 于 10 分鐘之內(nèi)完成血小板激活和染色步驟，操作時應(yīng)注意減少人工激活。 2. 血

3、小板激活： (1 試管內(nèi)加入 50mlADP，450ml 全血，輕輕搖勻。 (2 室溫孵育 5 分鐘。 (3 立即染色。 3. 熒光抗體染色： (1 Falcon 管編號。 (2 在對照管中加入 PE 同型對照、CD61 PerCP、PAC-1 各 20ml，RGDS 加 49 Flow Cytometry June 2000 10ml。 (3 在試驗管中加入三種抗體各 20ml。 (4 在對照管和試驗管中各加入未激活或激活的血標本 5ml。 (5 輕輕混勻，室溫暗處孵育 15-20 分鐘。 (6 各管中加入 1ml 冷的固定液 (2-8°C，充分混勻， 2-8°C 陰暗處

4、放置 30 分 鐘。 (7 24 小時內(nèi)上機分析。 4. 上機獲取數(shù)據(jù)： (1 開機： · · · · · · · · · 檢查鞘液筒裝滿，廢液筒倒空。 先打開流式細胞儀，再打開計算機。 儀器氣路加壓，排空氣泡。 做 FACSComp。 調(diào)出 獲取條件，F(xiàn)SC 和 SSC 選擇 Log 方式。 獲取條件為 CD61 PerCP 陽性。 使用對照管調(diào)整 FL1 和 FL2 的 PMT，使陰性群體位于 FL1 vs FL2 點圖 左下角。 分別使用 PAC-1 FITC / IgG1 PE / CD61 Pe

5、rCP 和 PAC-1 FITC+ RGDS / CD 62P PE / CD61 PerCP 調(diào)整 FL2-FL1 和 FL1-FL2 補償。 獲取各管的試驗數(shù)據(jù)。 (2 打開 CellQuest，順序放置對照管和試驗管，獲取數(shù)據(jù)： 5. 結(jié)果分析： 在 CD61 vs SSC 點圖中設(shè)門找血小板群。 CD61 vs SSC 點圖顯示有三群， CD61 陽性/低 SSC 一群主要由單個血小板組成，CD61 陽性/高 SSC 一群主要由黏附血小 板的血細胞組成， CD61 陽性/散射光更低的一群主要由血小板來源的 碎片組成。由于在生理和病理情況下，血小板群和紅細胞群的大小、顆粒度會有交叉， 因

6、此，不建議使用 FSC-SSC 圖設(shè)門。 在 CD61 vs SSC 點圖中找出 CD61 PerCP 陽性的血小板群 (單個血小板和黏 附在 WBC 上的血小板，設(shè)門。門內(nèi)做 PAC-1 FITC vs CD62P PE 點圖的雙參數(shù) 分析，統(tǒng)計結(jié)果。 50 Flow Cytometry June 2000 注意事項 1. 采血時請用大號針管，抽出的前 2ml 血應(yīng)棄去不用。 2. 盡量避免標本受到物理振動。 3. 取血后 10 分鐘內(nèi)完成染色操作。 4. 在 Falcon 管中加血標本 5ml， 管壁上不能有殘留血， 未染色的部分會影響試驗結(jié)果。 5. 為了檢測和控制血小板體外激活，建議使用正常未受激活的血標本平行做質(zhì)量控 制。 51 Flow Cytometry June 2000 附：BDIS 血小板活化試劑 BD 抗體： CD PAC-1 CD62P CD61 Isotype g1 CaliBRITE 3 Ig Subclass IgM IgG1 IgG1 Form FITC PE PerCP PE Unlabeled,FITC,PE,PerCP Catalog No. 340507 348107 340506 340013 340486 Tests 50 100 50 25mg 25 輔助試劑： 濃 RG