構(gòu)建免疫球蛋白與細(xì)胞因子融合基因做家族特異性抗淋巴瘤疫苗

1、構(gòu)建免疫球蛋白與細(xì)胞因子融合基因做家族特異性抗淋巴瘤疫苗 摘要 目的 構(gòu)建免疫球蛋白重鏈可變區(qū)（IgHV）基因片段與細(xì)胞因子GM-CSF或IL-2的融合基因表達(dá)載體作為家族特異性抗淋巴瘤核酸疫苗，接種動物了解該疫苗抗淋巴瘤免疫功能。方法 從臍帶血免疫球蛋白基因文庫810個IgHV3/Bluescript克隆獲得一些片段長度差異較大的基因片段，測序后利用生物信息資源分析預(yù)測其重鏈可變區(qū)的T細(xì)胞表位，同時分析本室以前構(gòu)建的IgHV1個片段。選擇包含了絕大多數(shù)細(xì)胞表位的IgHV1、IgHV3基因，分別將框架區(qū)(FR)為主的IgHV(FR)基因片段及IgHV(FR)與GM-CSF或IL-2基因連接后形

2、成的融合基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.0中。表達(dá)載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞， ELISA法確定GM-CSF或IL-2的表達(dá)情況。將一些表達(dá)載體作為核酸疫苗免疫小鼠，通過間接免疫熒光法和細(xì)胞因子分泌法檢測小鼠抗同一家族淋巴瘤和正常淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)。結(jié)果 分別將6個不同的IgHV3基因和個IgHV1克隆測序，翻譯為免疫球蛋白序列，利用Rammense計(jì)算機(jī)評分系統(tǒng)預(yù)測這些IgHV1、IgHV3序列上分別受HLA位點(diǎn)限制的T細(xì)胞表位，每個IgHV序列中約存在30個左右T細(xì)胞表位，90以上的T細(xì)胞表位位于框架區(qū)，積分排位于前10的T細(xì)胞表位都位于框架區(qū)。個代表性基因剪切去除CDR3區(qū)后構(gòu)建以

3、框架區(qū)(FR)為主的IgHV(FR)和IgHV(FR)pcDNA3表達(dá)載體。另外將GM-CSF或IL-2基因連接到個IgHV基因的3端。最終獲得IgHV(FR)、IgHV1(FR)GM-CSF、IgHV1(FR)-IL-2、IgHV3(FR)、IgHV3(FR)GM-CSF IgHV3(FR)-IL-2 種表達(dá)載體。表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，檢測48小時后培養(yǎng)上清中GM-CSF及IL-2。IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0及IgHV3(FR)-GM-CSF/ pcDNA3.0中GM-CSF的表達(dá)量高于對照組空質(zhì)粒pcDNA3.0 200倍以上；IgHV1(FR)-IL-2 /

4、pcDNA3.0和IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0中IL-2的表達(dá)量高于對照組空質(zhì)粒pcDNA3.0 60倍以上。肌肉注射IgHV1(FR)-IL-2免疫動物組在首次免疫后第2周開始檢測到抗屬于IgHV1家族的淋巴瘤Namalwa細(xì)胞系的抗體，IgHV1(FR)組在首次免疫后第4周開始檢測到抗Namalwa細(xì)胞抗體，IgHV3(FR)組、IgHV3(FR)-IL-2組和pcDNA3.0組小鼠始終對Namalwa細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。肌肉注射IgHV3(FR)-IL-2組在首次免疫后第2周開始檢測到抗屬于IgHV3家族的傳代淋巴細(xì)胞系的抗體，IgHV3(FR)組第4周開始檢測到抗體，而I

5、gHV1(FR)組、IgHV1(FR)-IL-2組和pcDNA3.0組對IgHV3家族傳代淋巴細(xì)胞系呈陰性反應(yīng)；這些陽性血清不與K562和Daudi細(xì)胞反應(yīng)，表明注射IgHV(FR)和IgHV (FR)-IL-2表達(dá)載體誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可以識別屬于同一家族的淋巴瘤或者其他淋巴細(xì)胞。IgHV1(FR)-IL-2 組和IgHV3(FR)-IL-2組免疫小鼠血清IFN-含量顯著高于pcDNA3.0組（P<0.01）；IgHV1(FR)-IL-2 組和IgHV3(FR)-IL-2組血清中IFN-含量顯著比IgHV1(FR)組和IgHV3(FR)組高(P<0.01)。IgHV1(FR)組和Ig

6、HV3(FR)組血清中IFN-含量與pcDNA3.0組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 應(yīng)用免疫球蛋白重鏈不同可變區(qū)中的框架區(qū)基因可以制備表達(dá)載體作為基因家族特異性抗淋巴瘤核酸疫苗，肌肉注射可以誘發(fā)小鼠的抗淋巴瘤免疫反應(yīng)。同時融合了細(xì)胞因子的表達(dá)載體可以明顯增強(qiáng)免疫反應(yīng)。關(guān)鍵詞 核酸疫苗；家族特異性；免疫球蛋白；框架區(qū)（FR）；細(xì)胞因子；淋巴瘤_ Construct immunoglobulin heavy chain variable region gene and cytokine gene co-expression vector as IgHV family specific

7、nucleic acid vaccine to lymphoma LIU Hui1，2, ZHU Ping1, LIN Ning-Jing1, ZHANG Ying1, BU Ding-Fang1, WANG Yi-Jia1, WANG Yi-Qun1,YANG-Ying1(1Peking University First Hospital, Beijing 100034 and 2Beijing Hospital, Beijing 100730, China)Abstract Objective To construct the immunoglobulin heavy chain vari

8、able region (IgHV) gene and GM-CSF or IL-2 gene co-expression vector as IgHV family specific nucleic acid vaccine to lymphoma, and study the immune response of the immunized mice against lymphoma. Methods To obtain a set of clones whose gene fragments are difference in length from a gene bank (810 o

9、f IgHV3/Bluescript) that we construct from normal fetal umbilical cord blood before. These gene fragments in the clones were sequencing. The sequences were translated into amino acid sequences. T cell epitopes in the IgHV were predicted by bioinformatics. Meanwhile 6 clones of IgHV1 constructed by o

10、ur lab before were analyzed. The most typical clone of IgHV1 and IgHV3 that contain the most of T cell epitopes were selected. The IgHV gene fragments that cut out complementary determining region 3 (CDR3) and composed mainly by framework region were cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.0

11、. Meanwhile, the gene fragments of framework region of IgHV that linked with gene of GM-CSF or IL-2 were cloned into pcDNA3.0 to form fusion gene of IgHV (FR)-GM-CSF/IL-2. Then they were transected into COS cells by Lipofectin and detected their transient expressing product by ELISA. Some of express

12、ion vectors were used as nucleic acid vaccine to immunize mice. Indirect immunofluorescence staining and ELISA were used to assess the immune response against lymphoma and lymphocyte that belong same or different IgHV family. Results Six clones of IgHV3 and six clones of IgHV1 were sequencing and tr

13、anslated into peptides. The bioinformatics of Rammense were used to predict T cell epitopes of various HLA types in the IgHV peptide sequences. About 30 T cell epitopes existed in each IgHV peptides. Among the bioinformatics prediction, about 90% of T cell epitopes were in the framework region (FR)

14、of IgHV, and the first 10% of higher prediction score were in FR. The CDR3 of two typical IgHV sequences were cut down and remained sequences (mainly composed of FR) were used to construct the IgHV1 (FR)/pcDNA3.0 and IgHV3 (FR) /pcDNA3.0 expression vectors. The 3 of IgHV1 (FR) and IgHV3 (FR) were li

15、nked GM-CSF or IL-2 gene. At last 6 of IgHV1 (FR)/pcDNA3.0, IgHV1 (FR) GM-CSF/pcDNA3.0, IgHV1 (FR)-IL-2/pcDNA3.0, IgHV3(FR)/pcDNA3.0, IgHV3(FR)GM-CSF/pcDNA3.0 and IgHV3(FR)- IL-2/pcDNA3.0 were obtained. The IgHV1 (FR)-GM-CSF/pcDNA3.0 and IgHV3 (FR) -IL-2/pcDNA3.0 were transfected into COS cells. In

16、the supernatant, the GM-CSF and IL-2 were detected after 48 hours culture. The expression of GM-CSF in the group transfected with IgHV(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0 are 200 times higher than the group transfected with control pcDNA3.0. The expression of IL-2 in the group transfected with IgHV(FR)-IL-2/ pcDNA3

17、.0 are 60 times higher than the group transfected with control pcDNA3.0. The antibody against IgHV1 family lymphoma cell line - Namalwa could be detected since the second week in the mice immunized with IgHV1(FR)-IL-2. The antibody could be detected since the fourth week in the mice immunized with I

18、gHV1(FR). The antibody couldnt be detected in the mice immunized with IgHV3(FR), IgHV3(FR)-IL-2 and control pcDNA3.0. The antibody against lymphocyte line of IgHV3 family could be detected since the second week in the mice immunized with IgHV3(FR)-IL-2. The antibody could be detected since the fourt

19、h week in the mice immunized with IgHV3(FR). The antibody against antibody against lymphocyte line of IgHV3 family couldnt be detected in the mice immunized with IgHV1(FR), IgHV1(FR)-IL-2 and pcDNA3.0. The antibody against K562 could not be detected in the serum of mice of all the five groups. These

20、 results indicate that the antibody against lymphoma and lymphocyte of the same IgHV family could be induced by IgHV(FR)/ pcDNA3.0 and IgHV(FR)-IL-2/pcDNA3.0. The quantity of IFN- in serum of the mice immunized with IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0 or IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0 were higher than immunized with I

21、gHV1(FR)/pcDNA3.0 or IgHV3(FR)/pcDNA3.0 or pcDNA3.0（ P<0.01）；There are no difference among the group of IgHV1(FR)/pcDNA3.0, IgHV3(FR)/pcDNA3.0 and pcDNA3.0（ P>0.05）. Conclusion The gene fragments of IgHV(FR) could be used to construct IgHV family specific nucleic acid vaccine to lymphoma .The

22、vaccine could induce anti-lymphoma immune response in mice by muscle injection. The expressing vectors of IgHV(FR)-GM-CSF/IL-2 could induce stronger immunoreaction. Key words nucleic acid vaccine; gene family specific; Immunoglobulin; framework region; Cytokine; Lymphoma淋巴細(xì)胞表面的免疫球蛋白可變區(qū)序列各不相同，稱為獨(dú)特型。利

23、用淋巴瘤表面特有的免疫球蛋白獨(dú)特型可以作為抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗淋巴瘤的免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)的目標(biāo)是針對獨(dú)特型上的抗原決定簇。迄今許多人認(rèn)為這些抗原決定簇主要位于免疫球蛋白可變區(qū)上的超變區(qū)（CDR區(qū)）。每個淋巴細(xì)胞克隆都有不同的CDR 區(qū)，如果希望利用誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法治療淋巴瘤，必須為每例患者提供不同淋巴瘤的不同CDR 區(qū)序列上的抗原來誘發(fā)免疫反應(yīng)。我課題組近期的工作發(fā)現(xiàn)，獨(dú)特型抗原的大部分抗原決定簇位于免疫球蛋白可變區(qū)（IgHV）的框架區(qū) 1。依據(jù)免疫球蛋白框架區(qū)的不同可以把淋巴細(xì)胞或者淋巴瘤細(xì)胞分為種基因家族。制備相應(yīng)的IgHV家族特異性框架區(qū)序列表達(dá)載體作為核酸疫苗，有可能誘發(fā)機(jī)體抑制相應(yīng)

24、的淋巴瘤的生長的免疫反應(yīng)。如果框架區(qū)序列與某種細(xì)胞因子序列形成融合蛋白共同表達(dá)還可能加強(qiáng)免疫反應(yīng)。本文克隆了IgHV1、IgHV3框架區(qū)基因片段，構(gòu)建IgHV1、IgHV3與細(xì)胞因子IL-2 或者GM-CSF的共表達(dá)載體，作為家族特異性抗淋巴瘤核酸疫苗注射給小鼠，觀察到這種類型的核酸疫苗可以成功誘發(fā)抗淋巴瘤免疫反應(yīng)。 材料與方法1. 克隆免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因片段：本室建立臍帶血免疫球蛋白基因文庫中IgHV3有810個IgHV3/pBluescript克隆，在2瓊脂糖電泳選擇片段長度差異較大的6個IgHV3片段測序，生物信息資源分析計(jì)算機(jī)評分系統(tǒng)預(yù)測選擇最適片段。含IgHV1家族個片段的Ig

25、HV1/pcDNA3克隆是本室以前構(gòu)建的2，同樣用計(jì)算機(jī)評分系統(tǒng)預(yù)測選擇最適片段。2生物信息資源分析計(jì)算機(jī)評分系統(tǒng)預(yù)測T細(xì)胞表位：通過 /tools/DNA.html，將得到的IgHV1、IgHV3重鏈可變區(qū)的核酸序列翻譯為氨基酸序列；在http:/ www.ncbi. /Igblast基因庫，與胚系重鏈可變區(qū)的氨基酸序列比較同源性，區(qū)分出4個框架區(qū)（FR）和3個超變區(qū)（CDR）；利用Rammense4 計(jì)算機(jī)評分系統(tǒng)預(yù)測獲得的IgHV1、IgHV3編碼序列上位點(diǎn)限制性T細(xì)胞表位。確定細(xì)胞表位分布，選擇代表性序列構(gòu)建表達(dá)載體。3構(gòu)建IgHV3、IgHV1去除CDR3區(qū)的真

26、核表達(dá)載體：根據(jù)T細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果從IgHV1、IgHV3序列中各選取1個在多種HLA型別均具有較高積分T細(xì)胞表位的序列為模板，PCR獲得IgHV1、IgHV3框架區(qū)基因片段，上游引物設(shè)計(jì)在IgHV1、IgHV3的引導(dǎo)區(qū)內(nèi)，5端設(shè)計(jì)了Kozak序列及KpnI的酶切位點(diǎn)；下游引物分別設(shè)計(jì)在它們的FR3區(qū)，5端設(shè)計(jì)了終止密碼子及EcoRI的酶切位點(diǎn)，序列如下：VH1上：5TATAGGTACCACCATGGACTGGACCTGGAG3VH1下：5TTAAGAATTCCTATCTCGCACAGTAATACACAGCCGT3VH3上: 5TATAGGTACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG

27、3VH3下：5TTAAGAATTCCTAAGTCGCACAGTAATACACGGCCGT325ml反應(yīng)體系含1.5 mmol/L MgCl2、1´buffer（Promega）、0.1mmol/L 4´dNTP （Promega）、0.25mmol/L引物、50-100ng模板DNA和1.25IU TaqDNA聚合酶（Promega）；94預(yù)熱5分鐘后接30個循環(huán)（9430秒，5630秒，7230秒），72延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)KpnI和EcoRI酶切后，定向克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.0中。選取陽性克隆測序（上海博亞生物技術(shù)有限公司）。4構(gòu)建IgHV1、IgHV3和

28、細(xì)胞因子融合基因真核表達(dá)載體：PCR獲得3端含接頭（linker）的IgHV1和IgHV3框架區(qū)基因片段:上游引物分別與VH1上和 VH3上相同，下游引物分別設(shè)計(jì)在它們的FR3區(qū)，5端設(shè)計(jì)了包含編碼10個親水性并有低電荷效應(yīng)的氨基酸序列作為linker，序列如下：VH1(FR)下:5AGAGCCTCCGCCACCGGATCCACCGCCACCTCTCGCACAGTAATACACAGCCGT3VH3(FR)下:5AGAGCCTCCGCCACCGGATCCACCGCCACCAGTCGCACAGTAATACACGGCCGT3PCR反應(yīng)條件同上。 PCR獲得5端含linker的GM-CSF和IL-2基

29、因片段: 用PcD-hIL-2和P-hGM-CSF質(zhì)粒（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫教研室馬大龍教授惠贈）作為模板擴(kuò)增hIL-2基因和hGM-CSF基因，在GM-CSF和IL-2基因上游引物5端設(shè)計(jì)了包含編碼10個親水性并有低電荷效應(yīng)的氨基酸序列作為接頭（linker），下游引物5端設(shè)計(jì)了終止密碼子及EcoRI的酶切位點(diǎn)，序列如下：hGM-CSF上：5GGTGGCGGTGGATCCGGTGGCGGAGGCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCA 3hGM-CSF下：5TTAAGAATTCCTAACTCCTGGACTGGCTCCCAGC3h-IL-2上：5GGTGGCGGTGGATCCGG

30、TGGCGGAGGCTCTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG3h-IL-2下：5TTAAGAATTCCTAAGTTAGTGTTGAGATGATGC3PCR反應(yīng)條件同上。將IgHV1和IgHV3框架區(qū)基因片段分別與GM-CSF和IL-2基因片段連接形成融合基因，取IgHV1和IgHV3框架區(qū)基因片各1ul分別與GM-CSF和IL-2基因片段1ul混勻，在PCR儀上94ºC變性10分鐘，逐漸退火，每30秒下降10ºC，至溫度下降至30ºC。在退火產(chǎn)物中加入Klenow片段、dNTP、buffer和去離子水室溫30分鐘，75ºC 10分鐘滅活Kl

31、enow片段。各取1ul上述反應(yīng)產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增IgHV1（FR）-GM-CSF、IgHV3（FR）-GM-CSF、IgHV1(FR)-IL-2 和IgHV3(FR)-IL-2融合基因, 上游引物分別用VH1上及 VH3上，下游引物分別用GM-CSF和IL-2的下游引物。PCR反應(yīng)條件同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)KpnI和EcoRI酶切后，定向克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.0中構(gòu)建IgHV1、IgHV3和細(xì)胞因子融合基因真核表達(dá)載體。選取陽性克隆測序（上海博亞生物技術(shù)有限公司）。將IgHV(FR)/ pcDNA3.0、IgHV(FR)-GM-CSF/ pcDNA3.0和IgHV(FR)-IL-

32、2/ pcDNA3.0在TOP10菌中大量擴(kuò)增，用QIAgen Giga 無內(nèi)熱源質(zhì)粒提取試劑盒大量提取質(zhì)粒。IgHV1、IgHV3和細(xì)胞因子融合基因真核表達(dá)載體在體外表達(dá)：通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法瞬時轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞系），在6孔板上接種2×105COS細(xì)胞（2ml/孔），37ºC CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后每孔細(xì)胞貼壁約60，細(xì)胞生長狀態(tài)好。IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0、IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0、IgHV3(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0和IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0各復(fù)種2孔，以pcDNA3.

33、0空質(zhì)粒復(fù)種2孔作為陰性對照。按照Invitrogen公司提供的轉(zhuǎn)染程序進(jìn)行，脂質(zhì)體Lipofectic:DNA為3：1（V/W）,導(dǎo)入外源DNA2ug/孔。轉(zhuǎn)染48小時后取培養(yǎng)上清，通過雙夾心ELISA法（DIACLONE公司）檢測上清中的GM-CSF及IL-2表達(dá)量。. 免疫動物獲得抗血清：將20只68周的健康純系雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分為五組，每組4只。第1組注射IgHV3(FR)/pcDNA3.0。第2組注射IgHV3(FR)-IL-2/ pcDNA 3.0。第3組注射空質(zhì)粒載體pcDNA3.0作為對照組。第4組注射IgHV1(FR)/pcDNA3.0。第5組注射IgHV1(FR)-

34、IL-2/pcDNA3.0。預(yù)先在小鼠雙側(cè)股四頭肌注射0.25%鹽酸布比卡因，每側(cè)50l，3天后分組免疫。各小鼠分別于第0、2、4周各免疫一次，共三次,100µg/次。分別于第0、2、4、6、8周經(jīng)小鼠眼內(nèi)眥血管取血留取血清。7. 間接免疫熒光法檢測小鼠免疫后抗Namalwa細(xì)胞和抗正常淋巴細(xì)胞抗體的生成情況：將淋巴瘤Namalwa(IgHV1家族)細(xì)胞、正常IgHV3家族B淋巴細(xì)胞、淋巴瘤Daudi細(xì)胞(非IgHV1、IgHV3家族)及紅白血病K562細(xì)胞（5×105/ml）離心機(jī)甩片，丙酮固定；將5組血清按一定比例稀釋作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗小鼠免疫球蛋白（DAKO

35、公司）作為二抗，熒光顯微鏡下讀片。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置3種陰性對照：以1：40稀釋的免疫前小鼠血清作為一抗，一抗和二抗均用PBS代替，僅一抗用PBS代替。8. 雙夾心ELISA法檢測小鼠免疫后血清中IFN-含量。按照晶美公司試劑盒說明。9. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：將各組的小鼠血清抗體滴度取負(fù)對數(shù)后，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。各組的小鼠血清的IFN-含量采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。 結(jié) 果1獲得免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因片段：從臍帶血免疫球蛋白基因文庫中有810個IgHV3/pBluescript克隆獲得片段長度均介于400500bp之間IgHV3基因片段，克隆產(chǎn)物經(jīng)KpnI和EcoRI酶切后出現(xiàn)預(yù)期條帶，選取6個片段長度差異較大

36、的IgHV3/pBluescript陽性克隆測序，測序結(jié)果顯示獲得了IgHV3基因家族不同的片段，主要差異位于CDR3區(qū)（序列圖略）。2生物信息資源分析選擇IgHV1、IgHV3：6個新構(gòu)建的IgHV3/pBluescript陽性克隆和本室保存的6個IgHV1/pcDNA3.0陽性克隆的IgHV基因和編碼氨基酸序列在 /Igblast基因庫與胚系重鏈可變區(qū)序列比較同源性。Rammense計(jì)算機(jī)評分系統(tǒng)預(yù)測這12個克隆的T細(xì)胞表位，積21分以上定為T細(xì)胞表位。每個IgHV1、IgHV3基因上有分別受HLA-A1、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-A*26、HLA-A3、HLA-

37、B*2705、HLA-B*4402、HLA-B*5101和HLA-B8等位點(diǎn)限制的T細(xì)胞表位30個左右，其中90以上的T細(xì)胞表位位于框架區(qū)，而且積分排位于前10的T細(xì)胞表位都位于框架區(qū)。將分析到的T細(xì)胞表位所在序列與本課題組以往克隆的急性淋巴細(xì)胞白血病可變區(qū)序列3及Lefranc5報(bào)導(dǎo)的胚系可變區(qū)代表序列分析到的T細(xì)胞表位所在序列進(jìn)行同源性分析，選擇家族特異性、代表性的IgHV1、IgHV3序列各一構(gòu)建表達(dá)載體。3獲得IgHV1、IgHV3家族特異性真核表達(dá)載體：IgHV1、IgHV3各1個在多種HLA型別均具有較高積分T細(xì)胞表位的序列為模板，PCR擴(kuò)增其框架區(qū)基因片段，片段長度約350bp左

38、右，產(chǎn)物經(jīng)KpnI和EcoRI酶切后，定向克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.0中，獲得IgHV1(FR)/ pcDNA3.0和IgHV3(FR)/ pcDNA3.0，兩者經(jīng)KpnI和EcoRI酶切后出現(xiàn)預(yù)期條帶（圖1，2），測序結(jié)果分別與IgHV1/pcDNA3.0、IgHV3/pBluescript測序結(jié)果比較，證實(shí)在IgHV1(FR)/ pcDNA3.0和IgHV3(FR)/pcDNA3.0去掉了IgHV1/pcDNA3.0、IgHV3/pBluescript的CDR3區(qū)，保留了其FR區(qū)，成功構(gòu)建IgHV1、IgHV3框架區(qū)組成的家族特異性真核表達(dá)載體。4獲得IgHV1、IgHV3和細(xì)胞因子

39、融合基因真核表達(dá)載體：經(jīng)PCR獲得在5端包含編碼10個氨基酸序列接頭（linker）的IgHV1(FR)和IgHV3(FR)片段，長度約380 bp左右；同時經(jīng)PCR獲得在3端包含編碼10個氨基酸序列接頭（linker）的GM-CSF和IL-2片段，片段長度分別為418bp和429bp；將IgHV1(FR)和IgHV3(FR)片段分別與GM-CSF和IL-2片段連接，經(jīng)PCR擴(kuò)增分別獲得IgHV1(FR)GM-CSF 、IgHV1(FR)-IL-2、 IgHV3(FR)-GM-CSF和IgHV3(FR)-IL-2融合基因片段，片段長度約800 bp，產(chǎn)物經(jīng)KpnI和EcoRI酶切后，定向克隆到

40、真核表達(dá)載體pcDNA3.0中，得到IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0、IgHV3(FR) -GM-CSF/pcDNA3.0、IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0和IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0。表達(dá)載體質(zhì)粒經(jīng)KpnI和EcoRI酶切后出現(xiàn)預(yù)期條帶（圖1，2）。將融合基因質(zhì)粒進(jìn)行雙向測序，結(jié)果顯示融合基因序列完全正確，無移碼突變和堿基錯配。5IgHV1、IgHV3和細(xì)胞因子融合基因真核表達(dá)載體可以在體外表達(dá)： ELISA檢測瞬時轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞48小時后培養(yǎng)上清中GM-CSF及IL-2的表達(dá)量（表1）。培養(yǎng)上清中IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDN

41、A3.0及IgHV3(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0中GM-CSF的表達(dá)量高于對照組空質(zhì)粒pcDNA3.0 200倍以上；IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0和IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0中IL-2的表達(dá)量高于對照組空質(zhì)粒pcDNA3.0 60倍以上。說明IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0和IgHV3(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0可在體外暫時表達(dá)并分泌GM-CSF; IgHV1(FR)-IL-2/ pcDNA3.0和IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0可在體外暫時表達(dá)并分泌IL-2。6.免疫動物血清抗體可識別同家族淋巴瘤細(xì)

42、胞或者同家族淋巴細(xì)胞的獨(dú)特型抗原:5組免疫動物第2、4、6、8周鼠血清與IgHV1家族淋巴瘤細(xì)胞系Namalwa細(xì)胞反應(yīng)， IgHV1(FR)-IL-2組在首次免疫后第2周開始檢測到抗Namalwa細(xì)胞抗體，IgHV1(FR)組在首次免疫后第4周開始檢測到抗Namalwa細(xì)胞抗體，IgHV3(FR)組、IgHV3(FR)-IL-2組和pcDNA3.0組小鼠的血清始終呈陰性反應(yīng)；5組免疫動物第2、4、6、8周鼠血清與IgHV3家族正常淋巴細(xì)胞系細(xì)胞反應(yīng)， IgHV3(FR)-IL-2組在首次免疫后第2周開始檢測到抗體，IgHV3(FR)組在首次免疫后第4周開始檢測到抗體，IgHV1(FR)組、I

43、gHV1(FR)-IL-2組和pcDNA3.0組小鼠的血清始終呈陰性反應(yīng)；小鼠陽性血清分別與K562和Daudi細(xì)胞行間接免疫熒光檢測不與K562和Daudi細(xì)胞反應(yīng)（圖3）。進(jìn)行血清倍比稀釋發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)陽性反應(yīng)的組在第6周時抗體滴度達(dá)到高峰，第8周開始下降（表2,圖4,5）。將第1組(IgHV3(FR)組)和第2組(IgHV3(FR)-IL-2組)以及第4組(IgHV1(FR)組)和第5組(IgHV(FR)-IL-2組)小鼠免疫后6周血清的抗體滴度取負(fù)對數(shù)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示第2組抗體滴度高于第1組,第5組抗體滴度高于第4組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05(分別為0.049825和0.024

44、008)。 7. 免疫動物血清中IFN-含量的檢測: IgHV1(FR)-IL-2 組和IgHV3(FR)-IL-2組與pcDNA3.0組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, P值分別為0.000453和0.000959 ；IgHV1(FR)組和IgHV3(FR)組血清中IFN-含量與pcDNA3.0組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.464644和0.356843)（表2）；IgHV1(FR)-IL-2 組和IgHV3(FR)-IL-2組小鼠血清中IFN-含量比IgHV1(FR)組和IgHV3(FR)組高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值為0.000134。討 論盡管腫瘤的化療和放療取得了很大進(jìn)展，但是這些療

45、法缺乏特異性，目前已經(jīng)認(rèn)識到，只有調(diào)動患者自身的免疫功能，才有望治愈腫瘤。腫瘤的免疫治療需要了解腫瘤相關(guān)抗原。淋巴瘤表面特有的免疫球蛋白獨(dú)特型抗原可以作為腫瘤抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗淋巴瘤的免疫反應(yīng)。這種免疫反應(yīng)的目標(biāo)是針對獨(dú)特型上的抗原決定簇。我們注意到6，B淋巴細(xì)胞依據(jù)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(IgHV)基因標(biāo)記分類，可以分為IgHV1-IgHV7個基因家族。正常人體內(nèi)分屬個家族的B細(xì)胞共同執(zhí)行免疫功能，各占一定的份額。如果某一家族的淋巴細(xì)胞克隆性擴(kuò)張而且失控，會導(dǎo)致淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤；如果各家族淋巴細(xì)胞所占份額異常，免疫反應(yīng)失衡，也可能導(dǎo)致自身免疫疾病。淋巴瘤同樣可以根據(jù)基因類型分成7個基因家族，

46、利用這一特征有可能發(fā)展針對某一基因淋巴瘤的新型免疫治療方法。各個IgHV基因家族的框架區(qū)完全相同,CDR有所不同。迄今許多人認(rèn)為這些抗原決定簇主要位于免疫球蛋白可變區(qū)上的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），主要在CDR3區(qū)，每個淋巴細(xì)胞克隆都有不同的CDR3 區(qū)。如果希望利用誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法治療淋巴瘤，必須為每例淋巴瘤患者制備不同的CDR3序列上的抗原來誘發(fā)免疫反應(yīng)。我課題組近期的工作發(fā)現(xiàn)，事實(shí)上獨(dú)特型大部分抗原決定簇位于免疫球蛋白可變區(qū)（IgHV）的框架區(qū) 1。我們從正常新生兒臍帶血標(biāo)本獲得IgHV1、IgHV3基因片段的框架區(qū)基因與正常胚系序列及B-ALL序列高度同源2，能代表其同一IgHV基因家族的

47、共同特性，即具有IgHV家族特異性，如果在框架區(qū)存在能誘發(fā)免疫反應(yīng)的抗原決定簇，則有可能制備出由框架區(qū)編碼基因構(gòu)成的IgHV家族特異性基因疫苗。我們利用Rammense4計(jì)算機(jī)評分系統(tǒng)預(yù)測從臍帶血獲得的IgHV1、IgHV3基因上分別受HLA-A1、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-A*26、HLA-A3、HLA-B*2705、HLA-B*4402、HLA-B*5101和HLA-B8等位點(diǎn)限制的T細(xì)胞表位，預(yù)測結(jié)果顯示，在每個IgHV序列中約存在30個左右T細(xì)胞表位，其中90以上的T細(xì)胞表位位于框架區(qū)，而且積分排位于前10的T細(xì)胞表位都位于框架區(qū)，提示能誘發(fā)免疫反應(yīng)的抗原決定

48、簇主要在在框架區(qū)，而且不同的HLA分子均可以在框架區(qū)內(nèi)找到與其匹配的抗原決定簇。我們在前一實(shí)驗(yàn)中3（中華醫(yī)學(xué)雜志待發(fā)表）曾經(jīng)體外合成了一段預(yù)測的T細(xì)胞表位是HLAA*0201識別的IgHV1框架區(qū)的9肽。用它作為抗原刺激T2細(xì)胞，可使T2細(xì)胞表面MHC分子表達(dá)增高，再進(jìn)一步把T2作為抗原呈遞細(xì)胞（APC），與HLAA0201人的外周血相作用，通過四聚體檢測外周血中肽特異性CTL細(xì)胞數(shù)量，外周血中肽特異性CTL細(xì)胞數(shù)量明顯增加，證實(shí)框架區(qū)9肽確實(shí)可以誘導(dǎo)肽特異性CTL細(xì)胞免疫反應(yīng)。國外一課題組 7-8測定了192例淋巴系統(tǒng)腫瘤患者的IgHV序列，也發(fā)現(xiàn)相當(dāng)多的抗原決定簇位于框架區(qū)，而且效價(jià)高的都

49、集中在框架區(qū)。我們設(shè)想，既然在IgHV框架區(qū)存在高效價(jià)抗原決定簇，有可能用IgHV框架區(qū)基因制備IgHV家族特異性基因疫苗，解決必須為每例患者制備個體化的獨(dú)特型疫苗的問題。因此我們從正常新生兒臍帶血標(biāo)本獲得IgHV1、IgHV3基因片段中找出IgHV同一基因家族的共同特性，克隆其框架區(qū)基因片段到真核表達(dá)載體，探討制備IgHV家族特異性抗淋巴瘤基因疫苗的可能性。為了加強(qiáng)免疫反應(yīng)，我們將GM-CSF或IL-2與IgHV1和IgHV3框架區(qū)基因構(gòu)建于同一載體中，使細(xì)胞因子在最適的地方及時間表達(dá)分泌，從而最高效地發(fā)揮其免疫增強(qiáng)作用，在構(gòu)建IgHV(FR)-GM-CSF和IgHV(FR)-IL-2融合基

50、因時，我們在引物中設(shè)計(jì)了包含編碼10個親水性并有低電荷效應(yīng)的氨基酸序列（Gly- Gly- Gly- Gly-Ser- Gly- Gly- Gly- Gly-Ser）作為接頭,甘氨酸結(jié)構(gòu)簡單，易于折疊，對融合蛋白的立體構(gòu)象影響小，從而使表達(dá)的IgHV(FR)、hGM-CSF及hIL-2的空間構(gòu)象盡量與天然產(chǎn)物相近，以保持其生物學(xué)活性。最終獲得了IgHV1(FR)、IgHV1(FR)GM-CSF、IgHV1(FR)-IL-2、IgHV3(FR)、IgHV3(FR)GM-CSF IgHV3(FR)-IL-2 種表達(dá)載體。比較空質(zhì)粒pcDNA3.0與融合基因克隆轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞后GM-CSF和IL-2

51、的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)融合基因表達(dá)載體能在真核細(xì)胞中有效表達(dá)并分泌GM-CSF和IL-2。動物實(shí)驗(yàn)表明融合基因表達(dá)載體能誘導(dǎo)出更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。IgHV(FR)、IgHV1(FR)-IL-2、IgHV3(FR)、IgHV3(FR)-IL-2 4種表達(dá)載體免疫小鼠（GM-CSF人鼠不同源而未作）均可以使小鼠產(chǎn)生抗同一家族淋巴瘤細(xì)胞的特異性抗體，該抗體可以識別同一家族淋巴瘤細(xì)胞表面的天然抗原決定簇，不識別其它淋巴瘤細(xì)胞表面抗原決定簇，也不識別K562細(xì)胞，提示所產(chǎn)生的抗體是基因家族特異性的；細(xì)胞因子連接組免疫動物所產(chǎn)生的抗體滴度更高。連接細(xì)胞因子的表達(dá)載體免疫動物不僅可以誘導(dǎo)動物產(chǎn)生特異性抗體，而且可以增強(qiáng)

52、被免疫動物的細(xì)胞因子IFN分泌，從而有可能通過細(xì)胞因子進(jìn)一步起到抗腫瘤的作用。免疫小鼠所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)還可以作用于同一基因家族的正常淋巴細(xì)胞，由于淋巴瘤往往是腫瘤患者體內(nèi)主要淋巴細(xì)胞克隆，某一基因家族的正常淋巴細(xì)胞所受影響與腫瘤惡性進(jìn)展相比，副作用有限。IgHV家族特異性基因疫苗調(diào)控某一群淋巴細(xì)胞生長的功能還可能有其它應(yīng)用潛力。許多文獻(xiàn)9報(bào)道系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和多發(fā)性硬化等自身免疫病發(fā)生淋巴細(xì)胞亞群的平衡紊亂，出現(xiàn)了寡克隆淋巴細(xì)胞增殖，如果能夠控制其生長就有可能治療自身免疫疾病。 參 考 文 獻(xiàn)1. 張野坪,朱平,石永進(jìn)等. TCR抗原決定簇DNA疫苗誘導(dǎo)抗淋巴瘤免疫反應(yīng)的分子機(jī)理. 中

53、華血液學(xué)雜志, 2002;23:68-72.2. 林寧晶,朱平,張野坪等.組合免疫球蛋白基因疫苗誘發(fā)小鼠抗淋巴瘤體液免疫反應(yīng) 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2002;82:766-770.3. 劉英,朱平,胡亞美. 急性B淋巴細(xì)胞白血病免疫球蛋白框架區(qū)肽作為T細(xì)胞表位體外擴(kuò)增肽特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞 中華醫(yī)學(xué)雜志,待發(fā)表.4. Rammense HG , Bachmann J . SYFPEITHY : database for MHC ligands and peptide motifs . Immunogenetics ,1999 ;50:213-2195. Lefranc MP . IMGT , the international immunogenetics database . Nucleic Acids Research , 2001 ; 29 : 207-209 .6. 朱平，劉繼華.急性淋巴細(xì)胞白血病惡性克隆的免疫球蛋白基因特征分析. 中華醫(yī)學(xué)雜志,2001;81:1057-1061.7. Harig S, Witzens M , Krakhardt, et al: Induction of cytotoxic T-cell responses against immunoglobulin V re