轉(zhuǎn)化生長因子-β3在2,3,7,8-四氯二惡英誘導的胎鼠腭裂組織中

1、轉(zhuǎn)化生長因子-3在2,3,7,8-四氯二噁英誘導的胎鼠腭裂組織中的表達變化蒲亞蘭，劉麗玲，甘立強，傅躍先基金項目 重慶市自然科學基金重點項目（2009BA5085）通信作者 傅躍先，電話：（023）63632270，Email：yuexianfu (400014 重慶，重慶醫(yī)科大學兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室)提要 目的 檢測腭發(fā)育關(guān)鍵時段腭突組織中轉(zhuǎn)化生長因子3（Transforming growth factor-3,TGF-3）的表達變化，探討TGF-3在2,3,7,8-四氯二噁英(2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p- dioxin, TCDD）誘導C5

2、7BL/6J胎鼠腭裂發(fā)生中的作用。方法 在小鼠懷孕第10天（Gestation day 10,GD 10），實驗組以TCDD 64 µg/kg灌胃，對照組以玉米油16 ml/kg灌胃，于GD 18.5解剖顯微鏡下觀察胎鼠腭裂的發(fā)生率，并于GD 13.5、GD 14.5和GD 15.5剪取胎鼠腭突組織提取RNA及蛋白，采用RT-PCR和Western blot分別檢測腭突組織中TGF-3 mRNA和TGF-3蛋白的表達情況。結(jié)果 GD 18.5實驗組腭裂的發(fā)生率為100%（39/39），對照組無腭裂發(fā)生(0/42)。GD 13.5、GD 14.5及GD 15.5實驗組TGF-3 mRN

3、A和TGF-3蛋白的表達均較對照組顯著增高（P<0.05）。結(jié)論 TCDD可誘導C57BL/6J胎鼠形成穩(wěn)定的腭裂實驗動物模型，并顯著上調(diào)胎鼠腭突組織中TGF-3的表達，TGF-3的過高表達可能是TCDD誘發(fā)先天性腭裂的主干信號通路之一。關(guān)鍵詞腭裂；2,3,7,8-四氯二噁英；轉(zhuǎn)化生長因子3中圖法分類號 R726.2 文獻標識碼 AThe expression of TGF-3 in 2, 3, 7, 8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin induced palatal cleft in mice PU Yalan, LIU Liling, GAN Liqiang,

4、 FU Yuexian (Department of Key Laboratory of Developmental Diseases in Childhood，Ministry of Education，Chongqing Medical University, Chongqing, 400014，China)Abstract Objective To explore the effect of transforming growth factor-3 (TGF-3) on palatal cleft of C57BL/6J mice induced by 2,3,7,8-Tetrachlo

5、rodibenzo- p-dioxin(TCDD) . Methods On gestation day 10(GD 10), the pregnant mice were randomly divided into two groups: the treated group mice were dosed with 64 µg TCDD/kg body weight, while the control group mice received 16 ml corn oil/ kg body weight. The embryos were examined under stereo

6、microscope to detect the incidence of cleft palate on GD 18.5, and the palatal shelves were dissected from the embryos for RNA and protein extractions on GD 13.5, GD 14.5 and GD 15.5. At last，the expression of TGF-3 mRNA and protein were respectively investigated by RT-PCR and Western blot. Results

7、Total frequency of clefts was 100% in TCDD group (39/39), and there was no cleft in the control group (0/42). The expression of TGF-3 mRNA and protein were gradually up-regulated in TCDD group on different phases of the developing palatal shelves(P0.05). Conclusion TCDD can induce a stable formation

8、 of cleft palate and up-regulate the expression of TGF-3, and the over expression of TGF-3 might be a key signal pathway resulting in TCDD-induced cleft palate.Key words cleft palate； 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin； transforming growth factor-3Supported by the Key Program of National Science Fo

9、undation of Chongqing (2009BA5085). Corresponding author: FU Yuexian, Tel: 86-23-63632270, E-mail:yuexianfu4先天性腭裂是由遺傳和環(huán)境因素相互作用導致的多因素畸形。在眾多環(huán)境因素中，2,3,7,8-四氯二噁英(2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD）被引起了廣泛的重視。研究證實，TCDD是毒性最強的環(huán)境致畸物并可誘發(fā)小鼠腭裂1。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TCDD誘導的胎鼠腭裂其腭突組織中轉(zhuǎn)化生長因子-3（Transforming growth fact

10、or-3, TGF-3）的表達在孕第14.5天（Gestation day 10,GD 14.5）明顯增高2，但對于整個腭突融合過程中TGF-3的表達變化情況，罕見國內(nèi)外相關(guān)報道。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，著重對腭發(fā)育的主要時點腭突組織中TGF-3的表達進行動態(tài)觀察，以全面了解TGF-3在TCDD誘導胎鼠腭裂發(fā)生中所扮演的角色。1 材料與方法1.1 實驗動物810周齡、體重2023 g清潔級C57BL/6J小鼠，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心許可證號：SCXK（渝）20050002。1.2 主要實驗試劑 玉米油（Sigma-Aldrich，USA），TCDD（Sigma-Aldrich，USA）

11、，RNApure高純總RNA快速抽提試劑盒（離心柱型）（百泰克，中國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（IBM，美國），2×Power Taq PCR MasterMix（百泰克，中國），瓊脂糖（TaKaRa, 日本），蛋白提取試劑盒（凱基，中國），蛋白定量試劑盒（百泰克，中國），SDS-PAGE凝膠試劑盒（凱基，中國），PVDF膜（millipore，美國），小鼠TGF-3單克隆抗體（abcam, USA）,抗GAPDH鼠單克隆抗體（康為世紀，中國），山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP二抗（康為世紀，中國），ECL檢測試劑盒（凱基，中國）。1.3 動物模型的建立12只孕鼠于GD 10隨機分為實驗組和

12、對照組，每組6只。實驗組予以TCDD 64 µg/kg（用玉米油配制成4 µg/ml)灌胃，對照組予以等量（16 ml/kg）玉米油灌胃。于GD 18.5頸椎脫臼法處死孕鼠，剖腹取出胎鼠，解剖顯微鏡下觀察腭突發(fā)育情況，并統(tǒng)計腭裂發(fā)生率。1.4 總RNA和總蛋白的提取及定量檢測 18只孕鼠于GD 10隨機分成實驗組和對照組，每組9只，處理方法同上。由于分子表達的時空特異性，提取RNA和蛋白時，根據(jù)標本的采集時間不同，每組又分為3個亞組：GD 13.5、GD 14.5、GD 15.5，每個亞組3只孕鼠，在解剖顯微鏡下剪取腭突組織，按試劑盒操作說明分別提取總RNA和總蛋白，然后用

13、ND100 0分光光度儀測定RNA濃度及OD260OD280值，用BCA法進行蛋白定量。1.5 RT-PCR檢測TGF-3 mRNA表達各取2 µg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，方法參照產(chǎn)品說明書。根據(jù)GenBank中公布小鼠TGF-3基因序列，按照引物設(shè)計原則設(shè)計引物序列如下：TGF-3上游引物：5-GCC CTG GAC ACC AAT TAC TGC TT-3，下游引物：5 -GCA CTT ACA CGA CTT CAC CAC CAT-3，PCR擴增片段長度為333 bp；內(nèi)參-actin上游引物：5-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GC-3，下游引

14、物：5 -CCA CAG GAT TCC ATA CCC AA-3，PCR擴增片段長度為446 bp。所有引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。PCR反應體系為：ddH2O 7.0 µl、2×Power Taq PCR MasterMix (含染料) 10.0 µl、上游引物0.5 µl、下游引物0.5 µl、cDNA 2.0 µl，總體系 20.0 µl。PCR反應條件為：94預變性5 min，94變性30 s, 62退火30 s，72延伸50 s，共30個循環(huán)，最后72再次延伸5 min。各取5 µl

15、PCR產(chǎn)物在含EB的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，140 V，40 min；然后在紫外凝膠成像儀上成像分析，以特異性擴增產(chǎn)物條帶與相應內(nèi)參條帶吸光度比值表示TGF-3mRNA的表達水平。1.6 Western blot檢測TGF-3蛋白的表達各取50 µg總蛋白進行10%SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入TGF-3一抗（3 µg/ml）或GAPDH一抗（1:100 0）4孵育過夜，次日加入山羊抗小鼠二抗（1:300 0）室溫孵育2 h，ECL化學發(fā)光法顯色，自動凝膠成像分析儀上成像分析，以TGF-3蛋白條帶的積分灰度值與GAPDH的積分

16、灰度值的比值表示TGF-3蛋白的表達水平。1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(±)表示，兩樣本間均數(shù)比較采用t檢驗(方差不齊者采用t檢驗)。 P<0.05，視為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 TCDD誘導胎鼠腭裂模型的建立GD 18.5，兩組胎鼠均為活胎，無死胎及胎吸收。實驗組6只小鼠孕有39只胎鼠，全部為腭裂。對照組6只小鼠孕有42只胎鼠，無腭裂發(fā)生。實驗組、對照組胎鼠腭部大體解剖學表現(xiàn)見圖1。A為對照組（×20）；B為實驗組（×20）圖1 GD18.5胎鼠腭部大體解剖學表現(xiàn)（黑色箭頭所指為小鼠腭部

17、）2.2 TGF-3 mRNA的表達情況RT-PCR顯示，實驗組腭突內(nèi) TGF-3 mRNA的表達在GD 13.5, GD 14.5和GD 15.5均明顯增高，與對照組比較具有顯著差異（P<0.05）（圖2，表1）。M600bp100bp 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12M：DNA標準（DL600）；16為對照組；712為實驗組；13和1012為-actin（446 bp）；49為TGF3（333 bp）；1、4、7、10為GD13.5；2、5、8、11為GD14.5；3、6、9、12為GD15.5圖2 RT-PCR檢測TGF-3 mRNA在胎鼠腭突中表達表1 實

18、驗組和對照組不同時間點TGF-3 mRNA相對內(nèi)參表達值(n=3，±) GD13.514.515.5對照組0.081±0.0200.178±0.0110.113±0.016實驗組0.392±0.056a0.467±0.064b0.192±0.032ca： P<0.05（t=-12.732），b：P<0.05（t=10.854），c：P<0.05（t=5.406），與對照組比較2.3 TGF-3蛋白的表達情況與TGF-3 mRNA表達情況一致，Western blot顯示實驗組腭突內(nèi) TGF-3 蛋白的表達在

19、GD 13.5,GD 14.5和GD 15.5均明顯增高，與對照組比較具有顯著差異（P<0.05）（圖3，表2）。TGF-3（47×103） 1 2 3 4 5 6GAPDH（36×103）13為實驗組；46為對照組；1、4為GD13.5；2、5為GD14.5；3、6為GD15.5圖3 Western blot 檢測TGF-3 蛋白在胎鼠腭突中表達表2 實驗組和對照組不同時間點TGF-3蛋白相對內(nèi)參表達值(n=3，±) GD13.514.515.5對照組0.017±0.0010.039±0.0030.005±0.001實驗組0.

20、046±0.009a0.089±0.015b0.028±0.003ca：P<0.05（t=5.678），b：P<0.05（t=5.615），c： P<0.05（t=13.715），與對照組比較3 討論腭的發(fā)育是一個多因素綜合作用的過程，包括腭突生長、上抬及融合等步驟。胎鼠GD 10.5左右，球狀突和上頜突形成上唇和原腭；GD 12.5GD 13.5，腭板在舌體兩側(cè)垂直生長；GD 14.5，腭板上抬至舌體上方水平位置；然后，兩側(cè)腭板水平方向繼續(xù)生長于中線處接觸，使腭中嵴上皮細胞（Medial edge epithelial, MEE）暫時呈復層上皮

21、細胞形成腭中線（Midline epithelial seam, MES）3。隨后MEE經(jīng)細胞凋亡、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial mesenchymal transformation, EMT）及MEE向口腔/鼻腔樣上皮轉(zhuǎn)化4-6而消失。GD 15.5，腭板進一步間充質(zhì)化融合。這一進程中的任何環(huán)節(jié)發(fā)生異常都會導致腭裂的產(chǎn)生。TCDD是毒性最強的環(huán)境污染物之一，廣泛來源于汽車尾氣、化工冶金工業(yè)、垃圾焚燒等7。TCDD分布廣泛、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易于經(jīng)環(huán)境復合物及食物鏈在生物體內(nèi)積聚8。尤其是對兒童，TCDD可導致廣泛的生理和毒理反應，包括生殖和發(fā)育缺陷1，如先天性腭裂和腎積水等。早期研究發(fā)現(xiàn)，

22、GD 9.0GD 12.0是二噁英誘導胎鼠腭裂的敏感窗口期9。故，本實驗選擇在GD 10.0 給藥，劑量參照國外文獻報道的64 µg/kg10，遂成功誘導出胎鼠腭裂模型，腭裂發(fā)生率為100%，無死胎及胎吸收等現(xiàn)象，較李承浩等11用24 µg/kg TCDD誘導胎鼠腭裂55.56%的發(fā)生率顯著增高。TGF-3為TGF-超家族成員，有廣泛的生物學作用，參與調(diào)控細胞增殖、EMT及細胞凋亡等12。TGF-3為腭突發(fā)育過程中的關(guān)鍵因子，特異性地表達于胎鼠腭突形成關(guān)鍵時期的MEE中13，促進MEE細胞凋亡、EMT及MEE向口腔/鼻腔樣上皮轉(zhuǎn)化4-6，進而促進腭突融合；TGF3-/-胎鼠

23、MEE細胞凋亡減少、EMT減弱，導致細胞附著受損、腭板融合不能6，最終形成腭裂。以上研究說明，TGF-3缺乏可導致先天性腭裂的發(fā)生。然而，環(huán)境污染物TCDD誘導的腭裂組織中TGF-3的表達情況是怎么樣的呢？課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，TCDD顯著上調(diào)腭突融合關(guān)鍵點GD 14.5胎鼠腭突組織中TGF-3的表達2。本研究在此基礎(chǔ)上更為系統(tǒng)、全面地研究了腭突融合前（GD 13.5）、融合時（GD 14.5）及融合后（GD 15.5）TGF-3的表達情況。結(jié)果顯示，實驗組TGF-3 mRNA和TGF-3蛋白的表達水平在GD 13.5、GD 14.5和GD 15.5均較對照組顯著增高，進一步證實了TCDD在腭

24、突融合的各個主要時段顯著上調(diào)胎鼠腭突組織中TGF-3的表達。并進一步確認，TGF-3過高表達亦可引起腭裂的發(fā)生。在本研究中，腭裂組織中TGF-3表達較正常腭突組織明顯升高，與課題組前期動物實驗2及臨床檢測14結(jié)果一致；但與柴茂洲等18研究結(jié)果差異較大。其研究結(jié)果是：TGF-3 mRNA的表達在GD 13.5無明顯變化，在GD 14.5和GD 15.5明顯降低。分析這種差異的可能原因有:所用誘導劑不完全相同。柴等18應用的誘導劑是TCDD和地塞米松聯(lián)合誘導，而本研究僅用TCDD一種誘導劑。推測，TCDD和地塞米松對TGF-3信號通路的聯(lián)合作用機制與TCDD單獨對TGF-3信號通路的作用機制可能有

25、所不同。所用TCDD劑量不同。柴等15應用TCDD的劑量為3 µg/kg，從GD 10開始連續(xù)3天灌胃；而本研究參照國外文獻報道方法予TCDD 64 µg/kg于GD 10一次灌胃10。故推測，TGF-3或其信號通路對不同劑量TCDD的反應亦可能不同。本研究進一步證實，TCDD可導致胎鼠腭裂的發(fā)生，并可顯著上調(diào)整個腭突融合過程中腭突組織中TGF-3的表達。TGF-3過高表達可能是TCDD誘發(fā)先天性腭裂的主干信號通路之一。但其具體的機制有待進一步研究。參考文獻:1 Vorderstrasse BA, Fenton SE, Bohn AA, et al. A novel eff

26、ect of dioxin: exposure during pregenancy severly impairs mammary gland differentiation J. Toxicological Sciences, 2004, 78(2): 248-257.2 Li-qiang GAN,Yue-xian FU,Xing Liu, et al. Transforming Growth Factor-3 Expression Up-regulates on cleft palates induced by 2, 3, 7, 8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin

27、 in miceJ. Toxicology and Industrial Health, 2009, 25(7):473-478.3 Ferguson MW. Plate development J. Development, 1988, 103Suppl: 41-60.4 Murillo J, Maldonado E, Barrio MC, et al. Interactions between TGF- beta1 and TGF-beta3 and their role in medial edge epithelium cell death and palatal fusion in

28、vitroJ. Differentiation, 2009, 77(2):209-220.5 Choi KY, Kim HJ, Cho BC, et al. A TGF-beta-induced gene, betaig-h3, is crucial for the apoptotic disappearance of the medial edge epithelium in palate fusion J. J Cell Biochem, 2009, 107(4): 818-825.6 Martínez-Alvarez C, Blanco MJ, Pérez R, et

29、 al. Snail family members and cell survival in physiological and pathological cleft palatesJ. Dev Biol, 2004, 265(1):207-218.7 Abbott BD, Birnbaum LS. TCDD alters medial epithelial cell differentiation during palatogenesis J. Toxicology and Applied Pharmacology, 1989, 99(2): 276-286.8 Moore JA, McConnell EE, Dalgard DW, et al. Comparative toxicity of three halogenated dibenzofurans in guinea pigs, mice, and rhesus monkeysJ. Annals of the New York Academy of Sciences, 1979, 320(5): 151-163.9 Pratt RM, Dencker L, Diewert VM. 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo- p-dioxin induced cl