硫酸化黃芪多糖對IBD疫苗接種雛雞免疫水平的影響.docxVIP

1、硫酸化黃茂多糖對IBD疫苗接種雛雞免疫水平的影響施志玉，黃小燕，李大鵬，孫瑾承，鞠演，胡元亮收稿日期：2008-09-12基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（30571360）；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)SRT計劃項目（0704A23）。作者簡介：施志玉（1986-），女，在讀本科生。通訊作者。（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095）摘要：200R14H齡雛雞隨機均分為9組，6個試驗組分別肌肉注射高、低劑魚的3種硫酸化黃芷多慵（sAPS）即sAPS、sAPS和sAPS,2個多糖對照組注射高、低劑量的未修飾黃茂多糖（APS）,無佐劑對照組注射等最生理鹽水，每天1次，連續(xù)3d,第4天用雞傳染性法氏囊病（IB

2、D）疫苗免疫，2周后二免。分別于首次免疫后第7,14,21,28天翼靜脈采血，用瓊脂擴散法測定血清抗體效價；于首次免疫后第14,21,28和35天心臟采血測定T淋巴細胞增殖。結(jié)果表明，3種修飾多糖均能顯著提高血清抗體效價，促進T淋巴細胞增殖，作用強于未修飾多糖,且有一定的量效關(guān)系，低劑量的效果優(yōu)于高劑量。綜合評價以sAPSeo的效果最好，可以作為新型免疫佐劑的候選。關(guān)鍵詞：硫酸化黃芷多糖；雛雞；血清抗體效價；淋巴細胞埴殖中圖分類號：S853.7文獻標識碼：A文章編號：0529-5130（2009）02-0006-03Effectsofsulfatedastragaluspolysacchari

3、desonimmuneresponsesofchickensinoculatedwithIBDvaccineSHIZhi-yu,HUANGXiao-yan,LIDa-peng,SUNJin-cheng,JUYan,HUYuan-liang*(CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)Abstract:Theeffectsofsulfatedastragaluspolysaccharides(sAPSs)onimmuneresponseinthechickensinoculatedw

4、ithIBDvaccinewereinvestigated.Twohundred14-day-oldchickenswererandomlydividedinto9groups.ThechickensinsixexperimentgroupswereintramuscularlyinjectedwithhighandlowclosesofsAPS,sAPSandsAPS,respectively,whilethreecontrolgroups,highandlowdosesofnon-modifiedAPSandnoadjuvantgroup(physiologicalsaline)weres

5、et.Theabovegroupsweretreatedonceadayforthreesuccessivedays.Ondays4aftertreatmentthechickenswereinoculatedwithinfectiousbursaldisease(IBD)vaccineandre-inoculatedafter18days.Ondays7,14,21and28afterfirstvaccination,thebloodsampleswerecollectedfrombrachialveinfordeterminationofserumantibodybyagardiffusi

6、on.Ondays14,21,28and35afterfirstvaccination,thebloodsampleswerecollectedbycardiopunclurefordeterminationofperipheralTlymphocyteproliferation.TheresultsshowedthatthreemodifiedsAPSscouldsignificantlyenhanceantibodytiterandpromotelymphocyteproliferationandpresentedadefinitedose-effectrelationship.Theim

7、muneregulationsofmodifiedsAPSswerebetterthanthoseofnon-modifiedAPS.Ingeneralevaluation,theefficacyofsAPSwasthebestandwouldbeexpectedasacandidateofnewimmuneadjuvant.Keywords：sulfatedastragaluspolysaccharide；chicken；serumantibodytiter；lymphocyteproliferation黃芷多糖（astragaluspolydsaccharide,APS）是中藥黃芷的主要有

8、效成分，具有多方面的活性，尤其是具有廣泛的免疫增強作用，能顯著提高雞新城疫和傳染性腔上囊病疫苗的免疫效果。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，黃茂多糖經(jīng)硫酸化修飾以后，能進一步提高雞新城疫疫苗的免疫效果。本試驗測定了硫酸化黃芷多糖（sulfatedAPS,sAPS）對雞傳染性法氏囊病疫苗免疫應(yīng)答的影響，旨在探討硫酸化修飾提高黃芷多糖的佐劑活性的可能性，篩選出效果較好的sAPS,為研制新型免疫增強劑提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1中藥與試劑APS、sAPS物、sAPS%和sAPS兇，由中獸醫(yī)學(xué)研究室提供，分別用PBS配制成高（8mg/mL）和低（4mg/mL）2種濃度，常規(guī)消毒備用。RPMI1640培養(yǎng)液為Gib

9、co公司產(chǎn)品，按說明書用三蒸水配制后過濾除菌，分裝，4Y保存，臨用前加小牛血清（杭州四季青生物制品廠）達10%和青霉素、鏈霉素各100U/mLo刀豆素球蛋白（ConA）,用RPMI1640培養(yǎng)液配制成0.025mg/mL,0.22pim微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20弋保存。四甲基偶氮哇藍（MTT）,Amresco公司產(chǎn)品，用pH7.4的PBS配成5mg/mL,0.22fim微孔濾膜過濾，避光4Y保存。淋巴細胞分離液，上海恒信化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號20001220o二甲亞硯（DMSO）,分析純，蘇州正興化工研究院產(chǎn)品。IBD抗原由本實驗室保存。1.2主要儀器DG-3022型酶聯(lián)免疫檢測儀，國

10、營華東電子管廠產(chǎn)品；CO?培養(yǎng)箱，美國Revc。公司生產(chǎn)；XSZ-D2型倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn)；75.2A型微量;振蕩器，上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn)；96孔細胞培養(yǎng)板，德國Nunclon公司生產(chǎn)。1.3動物分組及處理14日齡蛋公雞200只，隨機均分為9組?？瞻讓φ战M不做任何處理；6個試驗組分別肌肉注射兩種濃度的sAPSq、sAPSqsAPS曲，2個多糖對照組注射兩種濃度的APS,0.5mL/只，無佐劑對照組注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3d,第4天用4羽份法氏囊病中等毒力活疫苗（NF8株，南京藥械廠生產(chǎn)，批號0510637）滴鼻、點眼免疫，2周后二免。分別于首次免疫后第7（%）、14（服

11、）、21（DQ、28（D28）天每組隨機抽取6只翼靜脈采血，分離血清，測定血清抗體效價。于首次免疫后第14（D”）、21（D”）、28（D28）、35（D35）天每組隨機抽取3只，心臟采血5mL/只，肝素抗凝，測定淋巴細胞增殖。1.4血清抗體效價測定用AGPT法56、在血凝板上，每孔先加40皿PBS液，然后每排的第1孔加入40pX待檢血清，依次倍比稀釋直至第6孔。在瓊脂平板上，按七孔圖進行打孔，標記，封底。中間孔加入40aL4單位法氏囊抗原，周圍孔加入倍比稀釋的血清，同時設(shè)陽性血清、陰性血清及空白孔對照。加樣后于室溫靜置40min,移入濕盒內(nèi)，37Y孵育72h后判定結(jié)果，以出現(xiàn)沉淀線的血清最大

12、稀釋度為該血清的抗體效價。1.5淋巴細胞增殖測定用MTT法將抗凝血樣用Hankk液稀釋1倍，小心加在淋巴細胞分離液上層，2000r/min離心20min,吸取中間云霧狀白細胞層，用無血清RPMI1640營養(yǎng)液洗2遍，1500r/min離心15min。細胞計數(shù)，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2.5x"個/mL,加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，80孔，每孔再加20皿ConA，每個樣品重復(fù)4孔，然后置于39.5Y、5%CO2條件下培養(yǎng)44h,取出每孔加入MTT20皿，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加裂解液100皿，將細胞板置于微量震蕩器上震蕩5min使沉淀完全溶解，在酶聯(lián)免疫儀上檢測570nm處的

13、吸光（4570）值，作為T淋巴細胞增殖的指標。1.6數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)以平均值土標準差表示，用SPSS軟件進行Duncan's多重比較。2結(jié)果2.1血清抗體效價的動態(tài)變化首免后第7、14天，用瓊脂擴散法測不出血清中IBD抗體效價。一免后21d（二免后7d）,sAPSJK劑量組的抗體效價顯著高于APS的高、低劑量組和無佐劑對照組（P<0.05）,sAPS”低劑量組顯著高于APS高劑量組和無佐劑對照組（P<0.05）,sAPS對低劑量組稍高于APS的高、低劑量組和無佐劑對照組；一免后28d（二免后14（1）,所有修飾多糖組的抗體效價均顯著高于APS的高、低劑量組和無佐劑對照組（P&l

14、t;0.05）（表1）。表明3個修飾多糖在一定的劑量能提高顯著雛雞血清1BDV抗體效價,在一定時間點的作用強于APSOh高劑量（8mg/mL）；L低劑量（4m阿mL）。下同。表1血清IBDV抗體效價的動態(tài)變化log?組別1）2】sAPS40H2.5±0.500°5.4±0.244sAPSl4.3±0.62"5.6±0.244命sAPSjqh2.5±0.500'"5.3±0.478absAPSl2.7±0.478廈6.0土0.0008sAPSh2.3±0.667'4.8&

15、#177;0.750、sA%,4.7±0.333*5.2±0.374"APS2.0±0.00c3.3±0.250"APSl2.5±0.SOO1*1.7±0.333d無佐劑對照l.7±0.577v2.0±0.408d空白對照2.0±0.245。2.0±0.000d注：同列數(shù)據(jù)標注不同字母者表示差異顯著(P<0.05)o2.2淋巴細胞增殖的動態(tài)變化首次免疫后14d,sAPS”高劑量、sAPS”低劑量、sAPS"低劑量、sAPS的高劑量、sAPS低劑量和APS低劑量

16、組的么7。值顯著大于無佐劑對照組（P<0.05）,sAPS加低劑量和sAPS兇低劑量組顯著大于APS的高、低劑量組（P<0.05）；免疫后21d,，入探加低劑量和sAPSe低劑雖組的4珈值顯著大于無佐劑對照組和APS的高、低劑量組（P0.05）,sAPS低劑量組的a，。值顯著大于無佐劑對照組和APS的高劑量組（P0.05）；免疫后28d,各多糖組的值均顯著大于無佐劑對照組（尸<0.05）,sAPS低劑量組顯著大于APS高、低劑量組（P<0.05）；免疫后35d,，入處卸高劑量和APS低劑量高劑量組的A,。值顯著大于無佐劑對照組(PvO.05),(表2)。表明3個修飾多糖

17、在一定的時間點均能顯著sAPSjo高劑量組顯著大于APS低劑量組(P<0.05)促進雛雞外周血T淋巴細胞增殖，作用強于APS。表2淋巴細胞增殖的動態(tài)變化以珈)組別DmD21DmD35sAPSqh0.316±0.076"0.214±0.081福0.331±0.084c0.183±0.084"sAPSy0.626±0.096*0.448±0.028ab0.444±0.0630.141±0.049sAPSh0.167±0.057*0.178±0.0650.501±0

18、.011"0.262±0.017asAPSjql0.263±0.067日0.548±0.030*0.394±0.013。0.153±O.045、sAPSqh0.218±0.052&0.132±0.019d0.488±0.098b0.195±0.081廈sAPSql0.434±0.018b0.342±0.015b0.592±0.0】8，0.184±0.048*APSh0.161±0.0380.194±0.0350.377±

19、;0.078*0.208±0.019,bAPSl0.266±0.0120.27±0.093*0.292±0.042c0.145±0.028。無佐劑對照0.Hl土0.017,0.21±0.033*0.185±0.055d0.163±0.071?？瞻讓φ?.149±0.043f0.123±0.035d0.151±0.010d0.152±0.045c3討論已完成的研究證實，多糖的活性直接或間接地受到其分子結(jié)構(gòu)的影響。不少多糖經(jīng)過分子修飾后，其生物活性有一定的提高，甚至還增加了新的功

20、能。本試驗中抗體效價的測定結(jié)果表明，雖然修飾的和未修飾的APS組的抗體效價比無佐劑對照組均有所提高，但是各修飾多糖組的抗體效價多高于未修飾多糖組。這些結(jié)果證明，硫酸化修飾確實提高了黃芷多糖增強體液免疫的作用。T淋巴細胞增殖測定結(jié)果顯示，8個多糖組在相同時間點的4灑值大多顯著大于無佐劑對照組，表明修飾的或未修飾的APS均能顯著增強細胞免疫。進一步比較修飾多糖和未修飾多糖組可見，硫酸化修飾確實提高了黃芷多糖增強細胞免疫的作用。綜合比較3個修飾多糖的作用，sAPSw低劑量組的抗體效價顯著大于無佐劑對照組的總數(shù)最多，在免疫后21d抗體效價最高，免疫后28d的缶7。值最大，表明sAPS®的效果

21、好。有報道認為，硫酸多糖的活性與其硫酸基取代度有很大關(guān)系，硫酸根含量在每個糖殘基平均為1.52.0時最佳口°。本研究使用的3個硫酸化黃芷多糖中，以sAPSs的硫酸基取代度為最高(1.545),且剛好在1.52.0之間，所以其活性最強。從量效關(guān)系分析，3個修飾多糖低劑量組的抗體效價和由70峰值多高于高劑量組，抗體效價顯著大于無佐劑對照組的總數(shù)也最多，表明硫酸化黃茂多糖的增強免疫作用有一定的量效關(guān)系，低劑量的效果優(yōu)于高劑量。綜上所述，硫酸化修飾能提高黃芷多糖的增強免疫活性，硫酸化黃芷多糖能增強雞傳染性法氏囊病疫苗的免疫效果，且有一定的量效關(guān)系，低劑量的效果優(yōu)于高劑量。綜合評價以sAPSs的活性最強，可以作為新型免疫佐劑的候選藥。參考文獻：1 沈美玲，翟世康，羅英德，等.黃芷多糖生物活性的初步研究J.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1984,4(7)：420.2 李宏全，段縣平，馬海利，等.黃茂多糖對雞新城疫和傳染性腔上囊病疫苗免