豬輪狀病毒油乳劑滅活疫苗的制備及免疫原性試驗.docxVIP

1、豬輪狀病毒油乳劑滅活疫苗的制備及免疫原性試驗史月明'，葛俊偉】，喬薪曖】，劉力威2,張冠群李一經(jīng)I(1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省曾醫(yī)研究所，黑龍江齊齊哈爾161006)中圖分類號：S852.65+9.4丈獻標識瑪：B文章編號：0529-6005(2010)080027-02豬輪狀病毒(porcinerotavirus)屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)、輪狀病毒屬(Rotavirus)，是引起仔豬發(fā)生急性胃腸道傳染病的重要病原，自1975年Woode和Bridge首次從豬體分離出豬輪狀病毒以后，世界各國均有不同程度的豬輪狀病毒感染報道。在我國

2、豬輪狀病毒感染亦十分普遍，李國平等在調(diào)杏中發(fā)現(xiàn)仔豬110H齡陽性率42.4%66%,10日齡到斷奶陽性率83.2%91.7%,斷奶后陽性率為63.2%72%。臨床癥狀主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉，成年豬一般呈隱性感染。鑒于豬輪狀病能感染普遍,危害大，對豬進行疫苗接種預防豬輪狀病毒感染具有重要意義。收日耕200907-07基金項目：“卜一五”國家科技支押項目(2006BAD06A07)；黑龍江省“十一五”攻關(guān)項目(GA06B202-4)作者簡介：史月明(1983-),女，碩士.從事預防善明學研究通訊作者：李一經(jīng)，E-mail»yijingliYAYyXMK>«>&l

3、t;AV為垂要，首先考慮到引物的通用性，本文根據(jù)抗體可變區(qū)基因序列的保守性，合成了一對針對柬鏈可變區(qū)的通用引物，試驗結(jié)果顯示，擴增到328bp的重鏈可變區(qū)基因，經(jīng)序列測定后，發(fā)現(xiàn)該基因為小鼠免疫球蛋白基因。與鼠源單克隆抗體比較基因工程抗體的具有操作簡便、表達量:大、成本低廉的特點，用克隆的V區(qū)基因可產(chǎn)生與抗原特異性結(jié)合的抗體片段，利用基因突變技術(shù)改變抗體的某些結(jié)構(gòu)可提高抗體的親和力，比如單鏈抗體，嵌合抗體等.可延長其半衰期-8】。隨著分子生物學和免疫學技術(shù)的不斷發(fā)展，基用工程抗體勢必將會對人類的生產(chǎn)、生活起到更大的促進作用。本試驗通過RT-PCR技術(shù)成功擴增了抗JEVE蛋白單抗5D4重鏈可變區(qū)

4、基因，并對該基因進行了序列分析，結(jié)果顯示，該基因與小鼠免疫球蛋白基因相符。我們正在開展51)4基因工程抗體的研究，該基因克隆與序列分析為此研究奠定了戊好的基礎。本試驗旨在制備豬輪狀病程油乳劑滅活疫苗，并研究其免疫原性，為該疫苗的應用奠定基礎。1材料與方法1毒種、細胞和試驗動物豬輪狀病毒系國內(nèi)分離株JL94株細胞適應毒叫MA-104細胞自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心；家兔體重約2.5kg,購自哈藥集團實驗動物中心。1.2檢測抗原、抗體和主要試劑重組豬輪狀病毒VP6抗原，抗豬輪狀病毒VP6蛋白單抗山本實驗室制備保存7;滅活劑BEI購自Alfa-Aesar公司；10號白礦汕購自杭州煉油廠；司盤-8

5、0購自上海大眾制藥廠。1.3毒種的研究1.3.1原始毒種的鑒定將豬輪狀病毒JL94株細胞培養(yǎng)物接種MA-104細胞，進行擴大培養(yǎng)。將收獲的病扉純化后富通過電鏡觀察、RTPCR：3：及測序進行鑒定。參考文獻：1 vanDenHurkAF.MontgomeryBL.NorthillJA,ctal.Shortreport:thefirstisolationofJapaneseencephalitisvirusfrommosquitoescollectedfrommainlandAustraliaJ.AmJTropMedHyg,2006,75(1),21-25._2_LarrickJW.Potenti

6、alofmonoclonalantibodiesaspharmacologicalagentsCJl.PharmRev,1989,41s539-557.3 趙付榮.乍條虹，王斌.等.流行性乙型腦炎病毒E蛋臼單克隆抗體的制備與鑒定J.中國善醫(yī)雜志,2010,46(1):3-5.4 MartsevSP,ChumanevichAA.VlasovAP,etal.Antiferritinsingle-chainFvfragmentisafunctionalproteinwithpropertiesof&partiallystructurestate:comparisonwiththecomple

7、telyfoldedV(L)domainJJ.Biochemistry,2000«39(27).8047-8057.5 AsanoR,TakcmuraS,TsumotoK,etal.Functionalconstructionoftheanti-mucincoreprotein(MUC1)antibodyMUSE11variableregionsinabacteria!expressionsystem；J.JBiochem,2000.127(4),673679.6 WinterG,MilisteinC.Man-madeantibodiesTJ".Nature.1991,34

8、9(6307)：293-299.7 BenharI,PastanI.IdentificationofresiduesthatstabilizethesinglechainFvofmonoclonalantibodiesB3J：.JBiolChem,1995,270i23373-23380.8 MatsO,Henrik().MichaelM.etal.LightchainshufflingofahighaffinityantibodyresultsinadriftinepitoperecognitionIJ.MolecularImmunology,1996,33(1)；4756.1.3.2種子批

9、的建立基礎種毒的建立：取本實驗室保存的原始種毒進行傳代，每隔4代進行TCID50測定，當細胞毒價穩(wěn)定在10小lOTCIDso/O.2ml.,混勻后分裝.保存于一86C,制成基礎種毒。生產(chǎn)種毒建立：取基礎種毒，進行擴大培養(yǎng)，混合后分裝，保存于一86P,制備成生產(chǎn)種毒，用于制備疫苗。1.3.3毒種的細菌和支原體檢測按照中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準進行檢測。1.4制備疫苗滅活：生產(chǎn)種卷按終濃度1.5%加ABEL371滅活24h,加入2%硫代硫酸鈉終止滅活。滅活后抗原原液、十倍和百倍稀釋液接種MA-104細胞培養(yǎng)120h,觀察細胞病變。油相制備：取10號白油，加入硬脂酸鋁使其濃度達到2%,邊加邊

10、攪拌，加熱直至硬脂酸鋁全部溶解為止。然后加入司盤-80,使其終濃度達到6%,攪勻后停止加熱。水相制備：將滅菌吐溫80加入到滅活病毒懸液中，使其終濃度達到4%5%,充分攪勻，宜到吐溫80徹底溶解。乳化：取油相放入膠體磨中慢速攪拌.同時徐徐加入水相，使油相與水相體積比為1.5:1,800010000r/min乳化10min。終止攪拌前加入1%硫柳汞.使其終濃度為0.01%。L5疫苗物理性狀測定冷水表面試驗:將疫苗數(shù)滴滴于冷水表面，觀察是否擴散；黏度檢測：室溫用】mL吸管吸取疫苗1mL.使其自由落下，記錄滴下（）.4mL疫苗所需時間；穩(wěn)定性試驗：將疫苗3000r/min離心15min,分別骨37*C

11、和41冰箱觀察分層情況。1.6家兔免疫將家兔隨機分為2組，命名為首免組和二免組。各組均肌肉注射豬RV滅活油佐劑疫苗免疫1.5mL/只；2周后二免組進行同劑量同批次疫苗加強免疫，免疫前各組采血1次及免疫后每周采血分離血清，分裝后一86P保存?zhèn)溆谩?.7血清中豬RV特異性抗體水平檢測采用間接ELISA和細胞中和試驗進行檢測。2結(jié)果2.1原始種毒鑒定結(jié)果2.1.1電鏡檢查結(jié)果純化后病毒經(jīng)電鏡觀察，病毒顆粒略呈圓形，直徑為65nm75nm,形似車輪.為典型的輪狀病毒顆粒。見圖1。圖1電鏡下JL94病毒粒子形態(tài)（200000X）1. 1.2RT-PCR鑒定結(jié)果VP6全基因長1356bp,擴增產(chǎn)物約為13

12、00bp,與預期結(jié)果相一致.見圖20并將擴增產(chǎn)物通過序列測定與GenBank中JL94株VP6序列（AY538664）比對，相似度100%。2.2種子批毒種的建立基礎種毒的建立：將原始毒種JL94株進行培養(yǎng).增殖到第58代，收獲的毒價穩(wěn)定在108-2sTCID50/mL,見表1。將病毒按每包裝5mL,-86*C凍存，建立基礎毒種批。bpbp2000I000750500250100123圖2PRVJL94株VP6基因的RT-PCR結(jié)果1.DL-2000DNAMarker,2>RT-PCR產(chǎn)物；3：陰性對熙病毒稀擇度10310«10s10遍10，108毒價（TCIDso）CPE比率

13、4/44/44/44/44/43/410«-2S/mL表】病毒TCID的測定2.3毒種的細菌、支原體檢測結(jié)果毒種豬RV2.4疫苗的制備結(jié)果JL94株經(jīng)檢驗，均無需氧薄、厭氧菌、真菌和支原體2.4.1抗原液滅活檢測將BEI滅活抗原液的污染。原液、10倍稀釋液與100倍稀釋液接種于MA-生產(chǎn)種毒的建立：將基礎種子批病毒第58代進行擴大培養(yǎng)，按每包裝400mL,86*C凍存.建立工作毒種庫。104細胞后120h均無CPE出現(xiàn)，該抗原液滅活徹底。2.4.2疫苗物理性狀測定冷水表面試驗:疫苗滴于冷水表面，油滴邊緣整齊，不向四周擴散，說明疫苗是穩(wěn)定的油包水型；黏度檢測：】mL吸管吸取1mL疫苗室

14、溫垂直滴下所需時間為78s,在規(guī)定的黏度范圍內(nèi)；穩(wěn)定性試驗：3000r/min離心15min,37P放置21d,4*C放置1年，疫苗均未出現(xiàn)分層現(xiàn)象,說明疫苗具有良好的的穩(wěn)定性。2.5疫苗效力檢驗2.5.1間接ELISA檢測家兔體內(nèi)抗體水平首免組和二免組家兔血清中IgG抗體效價均有明顯的上升，峰值均為1:9600,至免疫后的21周首免組的抗體效價仍能維持在1:1000,二免組為1:40000見圖3O圖3豬RVBEI滅活疫苗ELISA檢測抗體效價圖3豬RVBEI滅活疫苗ELISA檢測抗體效價w«最蝎工-G-2.5.2中和抗體試驗檢測家兔體內(nèi)抗體水平首免組和二免組家兔，抗體效價變化規(guī)律性

15、基本一致,均在第3周抗體效價明顯升高.峰值均為1:1800,于免疫后14周抗體效價開始緩慢下降，免疫后2】周，首免組的抗體效價仍維持在1:119,二免組為1:230。見圖4。圖4豬RV疫苗(BEI滅活)中和抗體效價3討論本試驗利用我國豬輪狀病毒分離毒株JL94株制備油乳劑滅活疫苗.免疫家兔，通過細胞中和試驗和間接ELISA試毀，證明以該病毒為種毒，可以剌激機體產(chǎn)生免疫應答和保護性抗體，并呈現(xiàn)出一定的抗體消K規(guī)律。為了保證疫苗的免疫原性，制備病毒抗原時使病毒液的感染力滴度達到ICTTCIDso/mL以上。鑒于此，本試驗首先將豬輪狀病毒分離株JL94株在MA-104細胞系上傳代適應細胞，制備基礎種

16、毒。該病毒傳至第58代，滴度達到lOTCIDso/mL.對其擴大培養(yǎng)，制備出生產(chǎn)種毒，作為制備疫苗的抗原液。通過細胞中和試驗和間接ELISA試臆表明，首免組和二免組家兔血清抗體均升高明顯，于免疫后21周首免組中和抗體效價和ELISA效價分別為1-119和1:1000；二免組為1：230和1：4000。因輪狀病毒主要感染仔豬，符合疫苗免疫仔豬后免疫持續(xù)期的要求。比較兩種抗體檢測方法可以看出，ELISA檢測抗體變化規(guī)律和中和試驗檢測抗體變化規(guī)律大致相同，均在免疫后3周左右抗體效價明顯升高，持續(xù)到16周開始呈現(xiàn)下降的趨勢。同時也可看出，一次免疫和兩次免疫的效果相當，進行一次免疫即可。ELISA抗體檢

17、測方法簡單易行、操作方便，而中和試驗檢測方法比較繁瑣，因此.在實際檢測中采用ELISA方法也能反應疫苗免疫的有效免疫應答水平。上述試驗結(jié)果為該疫苗的應用奠定了基礎，疫苗對仔豬的保護尚待進一步研究。參考文獻：1 李國平，伊順仁，李發(fā)假.等.仔精輪狀痛淮的感染情況調(diào)查J.福建帝牧料醫(yī).1999,21(2),44-45.2 陳淑紅，王新生.師東方.等.豬輪狀病毒的分離鑒定及部分特性研究J.中國預防件灰筆報.2004,26(1),42-44.3 陳淑紅，師東方，李一經(jīng).豬輪狀病毒地方株JL94株VP6基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達J.畜牧獸醫(yī)學報.2004,35(4),443-448.4 邊亞蠟，林長水，王玉玲.等.抗豬輪狀病推VP6做克隆抗體的制備與密定J.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2006,37(4)；489-491.5 文喻玲,趙慶歡.于洋，等.知化健密度梯度離心純化輪狀病毒J】.中華現(xiàn)代內(nèi)科學雜志，2007,4(3),195-199.6 舌竹婷，析少華，楊宏軍.等.檢測牛輪狀病奇抗體間接ELISA方法的建立J.中國預防善醫(yī)學報.2009,31(3),213-214.7 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中