新城疫疫苗的研究進展(1).docx

1、新城疫疫苗的研究進展楊煦I劉玉芬-劉懷然3(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因逝點實驗室；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)浣哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽傳染病研究室)摘要嫁述了常規(guī)疫苗和基因工程疫苗2種類型新城疫疫苗的研完進展，分析制城疫疫苗的發(fā)展方向，以促進新城疫疫苗的璘充。關(guān)詞新戚疫；病斗；疫苗；研完進展中圖分類號S851文獻標識碼A文童編號1007-5739(2012)02-0325-03ResearchProgressesofNewcastleDiseaseVaccineYANGXu1LIUYu-fen1LH)Huai-ran3(1

2、CollegeofLifeScienceandTechnology,HarbinNormalUniversity,HarbinHeilongjiang150025;2KeyLaboratoryofBiologicalFunctionalGenes,NortheastAgriculturalUniversity;3DivisionofAvianInfectiousDiseases,StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,CAAS)AbstractResearchprogresses

3、ofncwcastlediseasevaccinewereoverviewed.includingconventionalvaccineandgeneticengineeringvaccine.Thedevelopmentdirectionofnewcastlediseasevaccinewasanalyzed.Itcouldpromotethestudyofnewcastlediseasevaccine.Keywordsnewcastledisease；virus；vaccine；researchprogresses新城疫病毒屬于副粘病毒科副粘病毒屬，為有囊膜的單股負鏈RNA病毒叫其基因組編

4、碼6個蛋白:RNA依賴的RNA聚合酶?；颍?、血凝素神經(jīng)氨酸酶（HN）、融合蛋白（P基因）、基質(zhì)蛋白（M基因）、磷蛋白（P基因）、核蛋白（作者簡介楊威（1987），女，*龍江哈爾濱人，在讀碩士研克生。研究方佝：動物生物化學(xué)與分子生物學(xué)。通訊作者收稿日期2011-12-09基因）囚。其中F蛋白有使病毒囊膜與宿主細胞融合進而導(dǎo)致病毒傳入宿主細胞膜的作用，是決定病毒毒力的關(guān)鍵因子。而HN蛋白是NDV的另一種重要的致病因子，它的主要作用是參與病毒粒子與細胞受體的最初吸附以及破壞這種吸附作用間。此外,HN蛋白還可使F蛋白充分接近受體而發(fā)生病毒與細胞膜的融合而致病。因此,NDV表面的HN-F糖蛋白在病毒的

5、傳染性和治病性上起到至關(guān)重要的作用，許多新城疫基因工程疫苗的研制都依賴于F、HN蛋白。新城疫（ND）是一種侵害禽類的急性高度接觸性傳染病，由新城疫病毒引起。自1926年首次在印度尼西亞的爪哇島和英國的新城暴發(fā)以來，至今已有4次世界范圍內(nèi)的大流行，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。NDV基因型已經(jīng)發(fā)生了很大的差異（I一XI）Z。雖然現(xiàn)有的滅活苗和弱毒苗能獲得較好的免疫效果，但是近年來由強毒引起的非典型ND在免疫雞群中時有發(fā)生，因而研究出安全、高效的新型疫苗一直備受有關(guān)學(xué)者的關(guān)注。目前，亞單位疫苗、活載體疫苗、新城疫病毒載體疫苗、DNA疫苗等都被廣泛研究。1常規(guī)疫苗1.1滅活苗滅活苗一般是由滅活的感染

6、性尿囊液與載體佐劑混合后制得，能夠刺激機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，使抗體以較高的水平在體內(nèi)持續(xù)較長時間，且易于儲存。目前，廣泛使用的滅活苗為油乳劑滅活苗，多用Ulster2e、Bl、LaSota及Rokin等作毒種來生產(chǎn)，這些毒株在雞胚中均能大量增殖，多用于二聯(lián)苗或多聯(lián)疫苗的制造，使用多聯(lián)苗可以節(jié)省勞動力，免疫效力受母源抗體影響較小，免疫后副作用小。但由于注射劑量和疫苗對免疫效果有很大的影響，且滅活疫苗中需要添加AvridineJSCOMS弗氏完全佐劑、礦物油、動植物油、脂質(zhì)體等佐劑，導(dǎo)致免疫成本大大提高。同時，接種滅活苗的機體產(chǎn)生針對病毒的特異性抗體，干擾臨床檢測檢疫以及流行病學(xué)調(diào)查，這是以滅活

7、苗防治ND的最大障礙。L2活疫苗活疫苗一般由感染胚尿囊液凍干而成，通過飲水、進食、噴霧、氣霧等途徑大規(guī)模免疫雞群。通常NDV活疫苗分為緩發(fā)型和中發(fā)型。B1株和Lasota株是天然弱毒株，幾乎無致病性，可作為緩發(fā)型疫苗，經(jīng)滴鼻、點眼、飲水、氣霧等途徑接種免疫，保護效果較好。而H株、Roakin株等屬中發(fā)型的疫苗，由于毒力較強，只能用于二次免疫。也有用CS2株、V4株等作活疫苗的，也能達到良好的免疫效果。活病毒感染能刺激機體產(chǎn)生局部免疫,免疫后可較快得到保護,一般接種后A5d就能產(chǎn)生抗體，抗體一般可維持20-30do主要產(chǎn)生黏膜抗體（IgA）,對機體呼吸道、消化道等局部獨膜免疫具有重要作用，是阻止

8、外界病毒入侵的屏障?；钜呙缫子诖笠?guī)模使用,較便宜，且疫苗毒還可以使免疫雞傳給未免疫雞，但由于環(huán)境條件及并發(fā)感染,可能引發(fā)疾病.母源抗體對初次免疫影響較大。此外，若在生產(chǎn)過程中控制不當，活疫苗易被滅活、污染，有毒力返強的危險。因此，為了使NDV得到更好的控制，人們又開發(fā)了其他類型的疫苗。2基因工程疫苗2.1亞單位疫苗利用重組DNA技術(shù)輔以佐劑將NDV保護性抗原基因在高效的表達系統(tǒng)中表達而制成亞單位疫苗。目前，桿狀病毒表達系統(tǒng)是研究ND亞單位疫苗的主要常用工具oNagyetal分別利用昆蟲桿狀病毒表達了NDV的F及HN蛋白，對雛雞進行免疫。結(jié)果表明，表達的F和HN蛋白能夠產(chǎn)生很好的免疫保護作用。丁

9、壯等何應(yīng)用該系統(tǒng)表達NDV四平和長春2個分離株的HN,用NDV強毒攻毒后，分別達到65%（四平株）和100%（長春株）的保護率。聞曉波等5構(gòu)建含有NDV的M、NP、F、HN4個基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，并得到了共表達的NDV的M、NP、F、HN4個蛋白，為進一步研究亞單位疫苗及NDV結(jié)構(gòu)蛋白之間的相互作用奠定了基礎(chǔ)。Kapczynskiet訕同用處理NDV的不具感染性的病毒HN和F蛋白免疫雞，經(jīng)驗證這些病毒亞單位成分具有良好的免疫保護效果。亞單位疫苗具有安全性高、穩(wěn)定性好、運輸方便、批量生產(chǎn)容易的優(yōu)點，是ND疫苗未來發(fā)展的一個重要方向，但是由于生產(chǎn)成本高，價格受限，很難真正用于疫苗生產(chǎn)，除非改進

10、表達技術(shù)，顯著降低成本。2.2新城疫病毒組活載體疫苗近年來，采用以病毒或細菌為載體研究新城疫活疫苗的技術(shù)路線被多數(shù)學(xué)者主張。將NDVF和HN基因在動物病毒弱毒或無毒株(如腺病毒、痘苗病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等)等載體上進行表達,均已獲得成功。目前，痘病毒、腺病毒和艷疹病毒等都是較為理想的病毒載體。1990年Tayloretal醐將新城疫病毒Texas株F基因插入禽痘病毒中，在培養(yǎng)細胞中得以表達，經(jīng)糖基化修飾后切割成F1和F2,通過點眼或口服重組病毒可獲得部分攻毒保護，而通過肌肉注射或翅下刺種，免疫1次就可獲得完全攻毒保護oMorganet將NDV的F、HN基因分別克隆入火雞抱疹病毒的復(fù)制非必需區(qū)(US

11、2),利用Rous肉瘤病毒LTR的強啟動子構(gòu)建重組病毒，用其腹腔接種SPF白來航雞，第28天后肌肉注射攻毒，表達F蛋白的重組病毒的保護率高達90%。曹殿軍等回將NDVHN基因在重組雞痘病毒中表達，以NDV強毒株F48E9攻毒發(fā)現(xiàn),接種重組病毒UTpfu/只時，保護力可達80%,而KTpfu/只時，保護力可達60%。說明該重組病毒對雛雞具有一定的保護作用，且該保護作用與接種劑量有一定的相關(guān)性。梁雪芽等回將含NDVF48E9株融合蛋白(F)基因的真核表達質(zhì)粒PCDNA3-F的減毒鼠傷寒沙門氏菌ZJ111株(ZJ111/PCDNA3-F)口服接種小鼠和雛雞，表明利用該減毒株作為載體傳遞DNA疫苗具有

12、相對安全性。用ZJ111/PCDNA3-F以108cfu/只免疫雛雞，2周后二免，二免后4周攻擊致死劑量的強毒株F48E9。結(jié)果表明：重組ZJ111/PCDNA3-F菌株不僅能誘導(dǎo)法氏囊B淋巴細胞和胸腺T淋巴細胞的增值反應(yīng)，而且能誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生NDV抗體，對強毒攻擊的保護率高于PCDNA3-F裸質(zhì)粒DNA疫苗注射免疫組(50.00%),達66.7%?；钶d體疫苗是當今及未來疫苗開發(fā)與研制的主要方向之一，其不僅具有傳統(tǒng)疫苗的許多優(yōu)點，而且還為多價苗及聯(lián)苗的生產(chǎn)開辟了新道路。23新城疫病毒截體疫苗隨著反向遺傳學(xué)的發(fā)展，重組NDV載體巳成為當今病毒載體系統(tǒng)研究的熱點之一?；贜DV可以誘導(dǎo)機體的體液免疫

13、和細胞免疫能在體內(nèi)增值,并長期表達抗原基因，使機體得到較強且較持久的免疫保護，且是一種RNA病毒，不會與宿主基因組整合，安全性較高，被學(xué)者們認為是很好的疫苗載體。Zhaoetal網(wǎng)分別在NDV強毒株和弱毒株的4個不同基因間區(qū)域插入外源基因，結(jié)果表明:NDV作為疫苗載體是完全可行的，因為病毒的復(fù)制效率和滴度并沒有受到影響。Peetemet應(yīng)叫以含禽副粘病毒4型基因的雜合體HN基因取代NDVHN基因，構(gòu)建的嵌合體病毒作為活疫苗可以產(chǎn)生對NDV的免疫保護以及對F蛋白的中和抗體,不僅能夠抵制致死劑量NDV的攻擊，而且根據(jù)其對HN所產(chǎn)生的抗體及血清分析即可區(qū)別于野生毒感染。2.4核酸疫苗核酸疫苗最早是由

14、Wolffetal的于1990年發(fā)現(xiàn)。他們注意到給小鼠直接肌肉注射質(zhì)粒DNA,質(zhì)粒及純化的DNA或RNA重組表達載體，可使載體上的基因在局部肌肉細胞內(nèi)表達，這種表達可持續(xù)數(shù)日甚至終身，且沒有檢出注射的外源核酸與宿主染色體的混合，之后William,Tangetal也證實了這點。1994年其被世界衛(wèi)生組織(WHO)正式統(tǒng)一命名為核酸疫苗(nucleicacidvaccine)o它是指把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動物體內(nèi)，使外源基因通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，刺激機體的免疫系統(tǒng)，使機體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。NDVDNA疫苗是將病毒的HN

15、或F基因通過表達質(zhì)粒DNA導(dǎo)入機體，產(chǎn)生針對這些抗原的特異性免疫反應(yīng)。對于DNA疫苗來說，載體質(zhì)粒要能在大腸桿菌中高拷貝地擴增，且在動物細胞內(nèi)能高效表達，但不能復(fù)制，也不能含有向宿主細胞基因組內(nèi)整合的序列。目前，常用的是含有巨噬細胞病毒(CMV)早期啟動子的載體質(zhì)粒oSakaguchimetal闡于1996年用小雞作模型進行包含新城疫F基因的質(zhì)粒DNA免疫雞試驗，結(jié)果表明：2/5用線性的F基因質(zhì)粒免疫雞產(chǎn)生了特異抗體，新城疫病毒DNA疫苗研究由此開始。陳吉祥等阿用表面活性劑CATB/DOPE脂質(zhì)體包裹DNVHN基因的真核表達質(zhì)粒PcHNM免疫5周齡雛雞，免疫1周后，.即可在雞血清中測出特異性H

16、I抗體，但裸DNA免疫HI抗體水平比脂質(zhì)體DNA免疫組要低。最后用強毒攻擊后，CTAB脂質(zhì)體DNA免疫組保護率能達到100%,而裸DNA只有81.82%,表明該質(zhì)粒DNA被脂質(zhì)體包裹后，提高了特異性抗體產(chǎn)生能力，加強了對強毒的抵抗力oYinetal曜究表明，利用r-干擾素和左旋咪哩2種佐劑協(xié)同作用制備的DNA疫苗，比單用DNA疫苗免疫效果更好,對試驗雞抵抗致死劑最NDV的保護率達80%。新城疫DNA疫苗具有免疫效果好，不存在散毒和毒力返強的危險；免疫應(yīng)答持久；方法簡便，價格低廉；可加工成干燥的小粒，便于貯藏和運輸。但是目前核酸疫苗的安全性、作用機理及如何提高免疫水平仍需進一步研究。3研究展望新

17、城疫是家禽傳染性疾病中危害最嚴重的疫病之一，對世界養(yǎng)食業(yè)危害極大，因此新城奇疫苗的開發(fā)和研制一直以來都是許多學(xué)者研究的熱點。目前，世界上常用疫苗為滅活苗和弱毒苗,它們在很大程度上控制了新城疫的蔓延，但也存在不足之處?；钜呙缈赡芤l(fā)疾病，有毒力返強的可能。油乳劑滅活苗不僅生產(chǎn)成本高，且不利于對疾病的監(jiān)控。隨著對NDV分子生物學(xué)特性的深入了解，基因工程疫苗越來越受人們的關(guān)注，但目前基因工程疫苗的研制仍存在一些問題。亞單位疫苗免疫周期短，成本較高;新城疫活載體疫苗和病毒載體疫苗在免疫效果上雖有很大突破，但對母源抗體的干擾仍有待完善;核酸疫苗尚處于起始階段之外，作用機理及生物安全性等問題都有待于提高。

18、因此，如何克服這些缺點,得到安全性高、免疫效果好、易于生產(chǎn)和成本低廉的新城疫基因工程疫苗是目前研究的重點。4參考文獻ALEXANDERDJ.Newcastlediseaseandotheravianparamyxovirusesfj.RevSciTech,2000,19(2)：443-462.1 KATTENBELTJA,STEVENSMP,GOULDARSequencevariantionintheNewcastlediseasevirusgenomeJJ.VirusResearch,2006,116(3)：168-184.2 聞曉波，閆麗輝,曹殿軍，等.新城疫病毒F48E9株M,NP,F和

19、HN基因的真核表達J.中國獸醫(yī)科學(xué),2006,36(6):429-433.3 HERCZEGJ.WEHMANNE,BRAGGRR,etal.Twonovelgeneticgroups(VIband)responsibleforrecentNewcastlediseaseoutbreaksinSouthernAfrica,one(VDb)ofwhichreachedSouthernEuropeJ.ArchVirol,1999,144(11)：2087-2099.4 LIUXP,WANHQ,NIXX,etal.Pathotypicalandgenotypicalcharacteriza-Tiono

20、fstrainsofNewcastlediseasevirusisolatedfromoutbreaksinchickenandgoo-seflocksinsomeregionsofChinaduring1985-2001J.ArchVirol,2003,148(7):1387-1403.5 NAGY,DERBYSHIREBB.DOBOSP,etal.CloningandexpressionofNDVhemagglutinin-neuraminidasecDNAinabaculovirusexpressionvectorsystem(J.Virology,1990,176(2)：426-438

21、.6 丁壯，金寧一，王興龍，等.雞新城疫病毒HN基因亞單位疫苗誘導(dǎo)免疫保護的實驗研究J.動物醫(yī)學(xué)進展,2002,23(1)：49-51.7 KAPCZYNSKIDR.TUMPEYTM.DevelopmentofavirosomevaccineforNewcastlediseasevini(J.AvianDis,2003,4(73):578-587.8 TAYLORJ.EDBAUERC,REY-SENELONGE,etal.Newcastledisease(上接第322頁)食量。二是確保飼料質(zhì)量。飼料以高蛋白、高消化率、高適口性的全價飼料為宜，不宜飼喂懷孕母豬的飼料。三是確保母豬分娩后能盡早吃足

22、，忌長時間控制母豬的飼料fit。四是確保斷奶前不減料。為了促進母豬盡快發(fā)情和多排卵，斷奶后繼續(xù)以泌乳料飼喂母豬，并且不控制其采食量。五是確保飲用水干凈、充足。高溫季節(jié)，要求一次性對仔豬進行斷奶。當仔豬吃補料超過600g,體重超過7kg,即可順利進行斷奶叫仔豬太早斷奶，會影響其成活率；太晚斷奶，又會降低(上接第323頁)蛹繭、潮繭。特別要杜絕收購人情繭叫蠶繭既烘部門要對當?shù)匦Q繭生產(chǎn)情況進行全面了解，收購前要至足人員、配齊用具、調(diào)試好設(shè)備。蠶繭烘干過程中，必須嚴格按照烘繭標準和技術(shù)規(guī)程正確操作，做到適溫烘繭，防止高溫急烘或低溫長烘，不烘過老繭和過嫩繭，要求適干叫.貯藏時，干繭首先選擇標準的庫房，干

23、繭不打熱包，堆放整齊。定人保管，定時翻包，開窗換氣，防止發(fā)生霉變和鼠害。virusfusionproteinexpressedinafowlpoxvirusrecombinantconferepro-tectioninchickeJJVirol,1990,64(4):1441-1450.9 MORGANRW.GELBJ.SCHREURSCS,etal.ProtecUonofchickensfromNewcastleandMarksdiseasewitharecombiantheip-scrivusofturkeys*vaccineexpressingtheNewcastlediseasevir

24、usfusionproteinJ.AvianDisease,1992(36):858-870.10 曹殿軍，劉惠莉，王莉林，等.新城疫病毒HN基因在重組雞痘病毒中的表達及其保護性的研究中國免疫學(xué)雜志,1998,14(1)：61-64.11 梁雪芽，方維煥,江玲麗.雞新城疫口服DNA疫苗的安全性、穩(wěn)定性與免疫效力JJ.生物工程學(xué)報,2003,19(1)：24-28.12 ZHAOH,BENP.PECTERSH,etal.RecombinantNewcastlediseasevirusasaviralvector：effectofgenomiclocationofforeigngeneongene

25、expressionandvirusrelicalionJJGenVirol,2003,84(4)：781-788.13 PEETERSBPH.DELEEUW0S.KOCHG.etal.RescueofNewcastlediseasevirusfromclonedCdna:EvidencethatcleavabilityofthefusionproteinisamajordeterminantforvirulenceJ).JournalofVirology,1999,73(6):5001-5009.14 WOLFFJA.MALONERW,WILLIAMSP.etal.Directgenetra

26、nsferintomousemuscleinvivo(J5cience,1990,247(4949):1465-1468.15 SAKAGUCHIM,NAKAMURAH.SONODAK,etal.ProtectionofchickenafromNewcastlediseasebyvaccinationwithalinearplasmidDNAexpressingtheFproteinofNewcastlediseaseviruesJ.Vaccine,1997(14):742-752.16 陳吉祥，藤飛群,CTAB脂質(zhì)體介導(dǎo)雞新城疫病毒核酸免疫研究平J.動物醫(yī)學(xué)進展，2001,22(1):41-43.17 YINJ.JINH.YANGF.etal.SynergisticeffectsofadjuvantsinterferongammaandlevamisolonDNAvaccinationagainstinfectionwithNewcastlediseasevirus(J.ViralInununol,2007,20(2)：288-299.+母豬繁殖力。因此，農(nóng)村養(yǎng)豬時仔豬奶斷奶時間以28日齡為宜。8參考文獻統(tǒng)崇鵬，毛婭卿，戴旭.提高母豬生殖力