反向微膠團(tuán)萃取與雙水相萃取

1、反向微膠團(tuán)萃取與雙水相萃取一、反相微膠團(tuán)萃取的概念 由于在水溶液中加入表面活性劑而形成的膠體結(jié)構(gòu)中，表面活性劑的活性基團(tuán)（即親水性部分）朝外，即靠向水溶液，而非極性基團(tuán)（即疏水性部分）則靠?jī)?nèi)而互相聚集成一種結(jié)構(gòu)。 上述情況發(fā)生在以極性液體（大多數(shù)情況下是水）作為溶劑的情況下。 如果溶劑為非極性液體，當(dāng)加入活性劑至一定濃度時(shí)，由于表面活性劑的極性和非極性基團(tuán)的定向排列，也會(huì)形成微膠團(tuán)結(jié)構(gòu)。但是這種結(jié)構(gòu)與上述結(jié)構(gòu)相反，表面活性劑的非極性基團(tuán)部分朝外，即朝向非極性溶劑部分，而極性基團(tuán)部分則朝內(nèi)，因而形成一種與水相微膠團(tuán)結(jié)構(gòu)反相的聚集體，這種聚集體就稱為反相微膠團(tuán)。 在反相微膠團(tuán)中，表面活性劑的極性基

2、團(tuán)部分圍成一個(gè)極性核心，稱為水池。這個(gè)水池包括表面活性劑的極性基團(tuán)內(nèi)表面和其中的水分，以及溶解于水中的離子等。具有親水性的大分子就可以溶解于水池中的水分而被以微膠團(tuán)的形式萃取出來(lái)。 將待分離組分以微膠團(tuán)形式進(jìn)行萃取的過程，稱為微膠團(tuán)萃取或膠團(tuán)萃取，如待分離組分是以反相微膠團(tuán)的形式被萃取，就稱為反相微膠團(tuán)萃取。二、反相微膠團(tuán)萃取的原理 在反相微膠團(tuán)萃取過程中，蛋白質(zhì)或酶等生物大分子主要以水殼的形式存在于反相微膠團(tuán)中的極性核心部分，能避免與有機(jī)溶劑直接接觸，因而可以盡量的保持整個(gè)萃取過程中生物大分子活性不喪失，這樣，既能溶出酶和蛋白質(zhì)等生物大分子，又能與水相分離，并盡可能的保存了這些生物大分子的生

3、物活性。 關(guān)于蛋白質(zhì)被反相微膠團(tuán)的萃取機(jī)理有三種見解：（1）在反相微膠團(tuán)中，由表面活性劑的極性部分圍成一個(gè)中心，中心為水等極性溶劑占有，生物大分子就溶解其中，并且在生物大分子周圍包膜著一層水殼，對(duì)生物大分子起保護(hù)作用。即所謂的水殼模型。此種說法最有說服力。（2）認(rèn)為生物大分子雖然溶解于表面活性劑極性部分圍成的中心，但在中心部分生物大分子是以被吸附的狀態(tài)附著于膠團(tuán)的極性壁上。（3）認(rèn)為生物大分子的非極性部分與多個(gè)微膠團(tuán)的非極性部分連接，由此形成生物大分子溶解于多個(gè)微膠團(tuán)之間的一種狀態(tài)。 反相微膠團(tuán)的形成、大小及形狀，與表面活性劑的種類、濃度以及操作時(shí)的溫度、壓力等有關(guān)。反相微膠團(tuán)一般比水相微膠團(tuán)

4、要小，其分子聚集數(shù)一般都小于50。而水相微膠團(tuán)的分子聚集數(shù)在50100之間。反相微膠團(tuán)中的水分含量通常用非極性溶劑中的水濃度和表面活性劑之比0來(lái)表示： 0H2O/表面活性劑0值越大，反相微膠團(tuán)內(nèi)的水分含量就越多，形成的反相微膠團(tuán)的半徑就越大。能溶解水溶性成分的量就越多。因此， 0值大小可以反應(yīng)出反相微膠團(tuán)的大小和溶解能力。1、表面活性劑和溶劑的種類表面活性劑在溶劑中的濃度必須達(dá)到一定值，否則就不能形成微膠團(tuán)，這個(gè)形成微膠團(tuán)所必須的最低濃度叫做表面活性劑形成微膠團(tuán)的臨界濃度（CMC）。 不同表面活性劑的CMC值在0.11mmol/L之間，隨溫度、壓力、溶劑的變化而變化。最常用:表面活性劑-丁二酸

5、二異辛酯磺酸鈉 （Aerosol OT，簡(jiǎn)稱AOT）， 溶劑-異辛烷（2，2，4三甲基戊烷）。AOT能溶解在有機(jī)溶劑中，也能溶解在水中，形成反相微膠團(tuán)。AOT在形成反相微膠團(tuán)時(shí)的0值較大，可達(dá)60。2、水相酸堿度 微膠團(tuán)內(nèi)水分的酸堿度主要影響到生物大分子的荷電性，進(jìn)而影響到生物大分子和反相微膠團(tuán)的結(jié)合。 AOT屬于陰離子型表面活性劑，其親水部分帶負(fù)電荷，形成的反相微膠團(tuán)內(nèi)表面帶負(fù)電。當(dāng)反相微膠團(tuán)內(nèi)水相的pH值小于生物大分子的等電點(diǎn)pI時(shí)，可使生物大分子帶正電，這樣生物大分子可與反相微膠團(tuán)中帶負(fù)電性的內(nèi)表面相吸，形成比較穩(wěn)定的含生物大分子的反相微膠團(tuán)，可以較容易的進(jìn)行萃取。3、水相中的離子強(qiáng)度

6、反相微膠團(tuán)中水相離子強(qiáng)度對(duì)反相微膠團(tuán)萃取的影響可以用鹽溶和鹽析現(xiàn)象來(lái)解釋。在低離子強(qiáng)度下，酶和蛋白質(zhì)等生物大分子表面上的荷電性和親水性得到了改善，溶解度上升，與反相微膠團(tuán)的內(nèi)表面的結(jié)合能力增強(qiáng)。當(dāng)水相中的離子強(qiáng)度升高到一定程度時(shí)，由于抵消了生物大分子表面上的電荷，并且由于離子的水化作用而使蛋白質(zhì)分子表面上的水膜消失，減少了與反相微膠團(tuán)的內(nèi)表面的結(jié)合作用，從而降低了溶解度，使分離效率降低。4、 0值的大小0值的大小也直接影響到反相微膠團(tuán)的萃取效率。0值太小，說明反相微膠團(tuán)內(nèi)的水分含量不高，對(duì)生物大分子的溶解度下降，甚至當(dāng)0值過小時(shí)，形成的反相微膠團(tuán)太小，生物大分子根本無(wú)法進(jìn)入反相微膠團(tuán)內(nèi)，這樣就

7、必然影響到萃取效率。反相微膠團(tuán)的分離過程分兩步：第一步：含生物大分子的反相微膠團(tuán)的形成第二步：反相微膠團(tuán)的破乳及生物大分子的釋放。形成含生物大分子的反相微膠團(tuán)的方法有多種，最常用到的有3種：1、相轉(zhuǎn)移法 通過含生物大分子的水相與溶解有表面活性劑的有機(jī)相接觸，緩慢的攪拌，在形成反相微膠團(tuán)的同時(shí)，其中的生物大分子就轉(zhuǎn)移到反相微膠團(tuán)中，直到處于萃取的平衡狀態(tài)為止。2、注入法 通過將含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性劑的有機(jī)相中，從而實(shí)現(xiàn)萃取過程。3、溶解法 對(duì)固體粉末中含有的生物大分子，或不溶于水的生物大分子，可采用溶解法進(jìn)行。其過程是先制備好含水（0330左右）的反相微膠團(tuán)的有機(jī)溶液，然后把

8、含生物大分子的固體粉末加入此中反相微膠團(tuán)的有機(jī)溶液中，同時(shí)攪拌，生物大分子慢慢地即可進(jìn)入到反相微膠團(tuán)內(nèi)的水中心而實(shí)現(xiàn)萃取過程。 生物大分子的釋放： 可參考液膜分離的方法，將混合液送入到澄清器中，使反相微膠團(tuán)與外相有機(jī)溶劑分離。然后對(duì)溶解有生物大分子的反相微膠團(tuán)進(jìn)行破乳以釋放其中的生物大分子，破乳的原理和方法有化學(xué)破乳和物理破乳等，可以參考液膜分離技術(shù)。 以溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的萃取為例說明影響萃取效果的因素1、水相pH值對(duì)蛋白質(zhì)萃取的影響 水相的pH值對(duì)蛋白質(zhì)的萃取影響較大。溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的萃取率在pH9時(shí)，接近100，隨著pH值的增大，萃取率下降，并在其 等電點(diǎn)時(shí)（pI11

9、.1）附近急劇下降，直至萃取率接近零。2、鹽濃度對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響該影響主要來(lái)自兩方面：（1）離子強(qiáng)度增大時(shí)，反相微膠團(tuán)內(nèi)表面的雙電層變薄，使蛋白質(zhì)表面與反相微膠團(tuán)表面之間的靜電引力下降；（2）反相微膠團(tuán)的內(nèi)表面的雙電層變薄后，也減小了表面活性劑極性頭之間的斥力，使反相微膠團(tuán)變小。反相微膠團(tuán)的大小正比于含水量0。3、蛋白質(zhì)相對(duì)分子量對(duì)萃取的影響 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分相對(duì)子量大于30000時(shí)，最大萃取率小于60，效果明顯下降，因此如何使反相微膠團(tuán)變得足夠大，使其能包住蛋白質(zhì)，是反相微膠團(tuán)萃取中有待解決的一個(gè)重要課題。4、陽(yáng)離子種類對(duì)萃取率的影響 陽(yáng)離子種類對(duì)萃取率的影響主要體現(xiàn)在改變反相微膠團(tuán)內(nèi)表面的電

10、荷密度上。通常反相微膠團(tuán)中表面活性劑的極性部分不會(huì)是完全電離的，有很大一部分陽(yáng)離子仍在膠團(tuán)的內(nèi)表面上。極性部位的電離程度愈大，反相微膠團(tuán)內(nèi)表面的電荷密度越大，產(chǎn)生的反相微膠團(tuán)也愈大。一、概述 雙水相萃取技術(shù)是60年代以來(lái)研究開發(fā)的新型分離技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物工程等領(lǐng)生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物工程等領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)了生物產(chǎn)品的分離和純化。90年代以來(lái)，采用雙水相萃取技術(shù)提取分離生物小分子的研究已有報(bào)道。1、概念 雙水相系統(tǒng)雙水相系統(tǒng)是指某些高聚物之間或高聚物與無(wú)機(jī)鹽之間在水中以適當(dāng)?shù)臐舛热芙?，形成的互不相溶的兩水相或多水相系統(tǒng)。 通過溶質(zhì)在相間的分配系數(shù)的差異，進(jìn)行組分分離或多

11、水相提取的技術(shù)即為雙水相萃取雙水相萃取。 混合物的不溶性最初是由貝杰林克（Beijerinck）通過把（明膠瓊脂）溶液與（明膠可溶性淀粉）溶液相混合時(shí)發(fā)現(xiàn)的。之后發(fā)現(xiàn)這是一種普遍現(xiàn)象，把多種不相溶的聚合物溶液混合在一起，可以得到多相體系，最多的有時(shí)達(dá)18個(gè)相。雙水相體系組成聚合物-聚合物-水聚丙烯乙二醇-聚乙二醇甲氧基聚乙二醇-聚乙烯醇聚乙二醇-葡萄糖聚乙烯吡咯烷酮-甲基纖維素鈉高分子電解質(zhì)-聚合物-水硫酸鹽葡聚糖鈉鹽-聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖鈉鹽-甲基纖維素高分子電解質(zhì)-高分子電解質(zhì)-水硫酸鹽葡聚糖鈉鹽-羧基甲基纖維素鈉鹽硫酸鹽葡聚糖鈉鹽-羧基甲基葡聚糖鈉鹽聚合物-低分子組分-水聚丙烯乙二

12、醇-磷酸鉀甲氧基聚乙二醇-磷酸鉀聚乙二醇-磷酸鉀聚丙烯乙二醇-葡萄糖 雙水相技術(shù)具有較高的選擇性和專一性，該技術(shù)簡(jiǎn)單、方便且不存在有機(jī)溶劑殘留等問題，因此有廣闊的應(yīng)用前景。 雙水相萃取也存在著某些缺點(diǎn)制約著其大規(guī)模應(yīng)用和發(fā)展，例如某些高聚物的價(jià)格高，常常需要高濃度的鹽才能進(jìn)行有效的分離，因此難以應(yīng)用于無(wú)法使用高鹽濃度的親和分離過程。2.原理在系線上各點(diǎn)處系統(tǒng)的總濃度不同，但均分成組成相同而體積不同的兩相。兩相的體積近似服從杠桿規(guī)則，即系線雙節(jié)線 在系線上各點(diǎn)處系統(tǒng)的總濃度不同，系線的長(zhǎng)度是衡量?jī)上嚅g相對(duì)差別的尺度，系線越長(zhǎng)，兩相間的性質(zhì)差別越大，反之則越小。當(dāng)系線長(zhǎng)度趨向于零時(shí)，即在圖b的雙節(jié)

13、線上c點(diǎn)，兩相差別消失，任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1，因此c點(diǎn)稱為臨界點(diǎn)a雙節(jié)線系線均相區(qū)兩相區(qū)臨界點(diǎn)b雙節(jié)線均相區(qū)兩相區(qū)系線臨界點(diǎn)3 .優(yōu)點(diǎn)： 雙水相萃取之所以受到重視主要是由于對(duì)生化分離具有明顯的優(yōu)點(diǎn)： (1)易于放大，各種參數(shù)可以按比例放大40000倍以上，而產(chǎn)物收率并不降低，這是其他過程無(wú)法比擬的，這一點(diǎn)對(duì)于工業(yè)應(yīng)用尤為有利；(2)由于雙水相系統(tǒng)之間的傳質(zhì)過程和平衡過程快速，因此相對(duì)于某些分離過程來(lái)說，能耗較小，而且可以實(shí)現(xiàn)快速分離。聚合物可以重復(fù)使，成本低。(3)易于進(jìn)行連續(xù)化操作，例如可以采用高分配系數(shù)和選擇性的多級(jí)逆流分配。 (4)由于雙水相的相間張力大大低于有機(jī)溶劑與水相之

14、間的相間張力，相分離過程溫和，使生化分子如酶不易受到破壞，而且可以直接在雙水相系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化以消除產(chǎn)物抑制； (5)由于雙水相系統(tǒng)受影響的因素復(fù)雜，從某種意義上說可以采取多種手段來(lái)提高選擇性或提高收率；(6)整個(gè)操作過程可以在室溫下進(jìn)行，操作條件溫和。 雙水相萃取在分離細(xì)胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)的過程中顯示出極大的優(yōu)越性和發(fā)展?jié)摿Γ?（1）大多數(shù)情況下目標(biāo)產(chǎn)物的回收率高于90； （2）目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)多在120范圍，一般都大于3； （3）大量雜質(zhì)蛋白能夠與所有固體物質(zhì)一起被去掉，與其他常用固液分離方法相比，雙水相萃取可省去一到兩個(gè)過程。二、影響組分在雙水相系統(tǒng)中分配的主要因子1.聚合物的相對(duì)分

15、子質(zhì)量 聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量增加，生物大分子或顆粒在該聚合物在該相中的分配系數(shù)會(huì)下降。2.成相溶液的濃度 當(dāng)成相溶液濃度接近臨界點(diǎn)時(shí)，可溶性組分會(huì)均勻的分配在兩相中，當(dāng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)時(shí)則趨向一側(cè)分配。3、無(wú)機(jī)鹽對(duì)于帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，其分配系數(shù)因陽(yáng)離子的存在按下列順續(xù)降低Li+NH4+Na+Cs+K+一價(jià)陰離子則按下列順序降低： F-Cl-Br-I-所以為了增加帶負(fù)電的蛋白質(zhì)的分配系數(shù)應(yīng)使用Li+、HPO42-、SO42-和2價(jià)檸檬酸根離子等，降低分配系數(shù)則用KCI、和NaCl。4、 pH值 pH值對(duì)組分的影響較為復(fù)雜。5、溫度 溫度的變化可以改變相的組成，溫度升高時(shí)，兩相中蛋白質(zhì)的分布趨于一致，增加聚合物的濃度，可