木聚糖酶活力特性研究-惠泉啤酒

1、木聚糖酶活力特性研究鄭翔鵬福建省燕京惠泉啤酒股份概況木聚糖酶分子只含一個(gè)亞基，分子量在830kD間的為堿性蛋白，分子量在 30145kD間的為酸性蛋白。PI值為310.5,穩(wěn)定pH值為310，反響最適pH值在47之間，最適溫 度為4060C。離子通過改變酶的構(gòu)象影響木聚糖酶的穩(wěn)定性，一般情況下，Ag+ 離子濃度1 mmol - L - 1 ,抑制酶活達(dá)100%、Hg2 + 離子濃度1 mmol L - 1 ,抑制酶活達(dá)7013%、 Cu2 + 離子濃度2. 00 mg - ml- 1 ,抑制酶活達(dá)25. 42% 等離子抑制木聚糖酶的活性 ,Mg2 + 離子濃度2. 00 mg - ml- 1

2、,提高酶活達(dá)6% 、Mn2+ 離子濃度1 mmol - L - 1 ,提高酶活 達(dá)24% 等離子那么能提高木聚糖酶的活性。Ag+ 、 Hg2 + 、 Cu2 +等離子主要通過改變酶分子中2SH基團(tuán)的復(fù)原態(tài)或直接攻擊酶分子中的某些氨基酸殘基，改變酶的構(gòu)象來(lái)抑制木聚糖酶的活性， Mg2 + 、 Zn2 +等那么通過影響酶與底物的結(jié)合及解離狀態(tài), 提高酶的活性 , 其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。木聚糖酶的分子結(jié)構(gòu)由功能結(jié)構(gòu)域和連接區(qū)構(gòu)成。 其中， 功能結(jié)構(gòu)域由催化結(jié)構(gòu)域和纖 維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成， 纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域可改變酶對(duì)可溶或不溶底物的活力。 根據(jù)結(jié)構(gòu)域的 相似性， 木聚糖酶可通過結(jié)構(gòu)域的改組和隨后

3、結(jié)構(gòu)域的修飾而進(jìn)， 許多木聚糖酶具有纖維素 酶的活性。木聚糖酶與木聚糖的結(jié)合利用離子間的靜電作用。木聚糖含有的4-0-甲基葡糖醛酸帶負(fù)電，木聚糖酶在 pH低于PI時(shí)帶正電荷，易于結(jié)合，而在 pH值高于PI時(shí)，那么不易 結(jié)合。其反響為典型的酸堿親核水解反響。木聚糖酶特性分析在對(duì)木聚糖酶的特性分析中， 著重分析酶活力與溫度、 PH 值、 鈣離子對(duì)酶活力的影響。1.1 木聚糖酶活力分析對(duì)于木聚糖酶活力的分析， 國(guó)標(biāo)中沒有相應(yīng)的推薦方法。 目前， 主要采用分光比色測(cè)定反響 液顏色的強(qiáng)度來(lái)定量分析酶的活力。木聚糖酶活力單位是指在 50C、pH值為5.3的條件下，每分鐘從濃度為10mg/ml的木聚糖溶液中

4、降解釋放 1卩mol復(fù)原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活 力單位 U。1.1.1 分析原理木聚糖酶能將木聚糖降解成寡糖和單糖。 具有復(fù)原性末端的寡糖和有復(fù)原基團(tuán)的單糖在沸水 浴條件下可以與DNS式劑發(fā)生顯色反響。反響液顏色的強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生的復(fù)原糖量成正比， 而復(fù)原糖的生成量又與反響液中木聚糖酶的活力成正比。1.1.2 主要試劑略1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制吸取水1.0ml，參加DNS式劑3.0ml，沸水浴加熱5min。用自來(lái)水冷卻至室溫，制成標(biāo)準(zhǔn)空 白樣。分別吸取木糖溶液 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml，分別用水定容至 100ml，配制 成濃度為 0.100.50mg/ml 木糖標(biāo)

5、準(zhǔn)溶液。 分別吸取上述濃度系列的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各 1.00ml 做二個(gè)平行，分別參加到刻度試管中，再分別參加3mlDNS試劑。電磁振蕩 3s，沸水浴加熱5min。然后用自來(lái)水冷卻到室溫，以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為對(duì)照調(diào)零，在540nm處測(cè)定吸光度OD值。以木糖濃度為 Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.1.4 樣品制備固體試樣應(yīng)粉碎或充分碾碎，然后過60目篩孔徑為0.25mm。液體試樣可直接稱取。稱取試樣，精確至 0.001g。參加250ml乙酸-乙酸鈉緩沖溶液。磁力攪拌30min，再用緩沖溶液定容至500ml，在4C條件下避光保存12h，過濾。再用緩沖溶

6、液做二次稀釋稀釋后的待測(cè)酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.040.08U/ml之間。測(cè)定吸取10.0ml木聚糖溶液，50C平衡10min。吸取10.0ml經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液，50C平衡10min。吸取1.00ml經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液已經(jīng)過50 C平衡，參加到刻度試管中，再參加1.0ml木聚糖溶液，50C保溫30min，立即參加3.0ml的DNS溶液混勻，沸水浴加熱5min 從 試管放入重新沸騰時(shí)算起。用自來(lái)水冷卻至室溫，在540nm處測(cè)定吸光度 A。吸取1.00ml木聚糖溶液已經(jīng)過 50C平衡，參加到刻度試管中，50C精確保溫30min。參加3.0mlDNS 試劑和1.00ml經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶

7、液，混勻，以終止酶解反響。沸水浴加熱5min 從試管放入重新沸騰時(shí)算起，用自來(lái)水冷卻至室溫，在540nm處測(cè)定吸光度Aq。計(jì)算rx Df木聚糖酶活力U/g = x 1000150.14x t式中：r :通過OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得與標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液相對(duì)應(yīng)的濃度ug/ml ;150.14 :木糖的相對(duì)分子質(zhì)量；t :酶解反響時(shí)間，min;Df :稀釋倍數(shù)酶活力的計(jì)算值保存三位有效數(shù)字。結(jié)果分析本研究分析了 8種各酶制劑廠家提供的復(fù)合木聚糖酶的活力，具體見表1。木聚糖酶的活力含量在125982402 ug/ml之間，差異相當(dāng)大。其中，在菌落總數(shù)總數(shù)方面，只有37.5%小于 50000cfu/ml 。表1

8、各酶制劑廠家提供的復(fù)合木聚糖酶的活力廠家樣品木聚糖酶活力ug/ml 或ug/g 備注菌落總數(shù)cfu/ml或cfu/g A12598V 50000B8540不計(jì)其數(shù)C9329V 50000D11246不計(jì)其數(shù)E4216不計(jì)其數(shù)F5488V 50000G4309不計(jì)其數(shù)H2402不計(jì)其數(shù)總平均68912.2溫度、PH值對(duì)木聚糖酶活力影響選擇表1中A、B、C三種酶進(jìn)行相關(guān)分析。其中，對(duì)溫度影響參數(shù)選擇為：底物濃度0.5%sigma 木聚糖，PH6.5，反響時(shí)間30min，溫度范圍為3575C,具體見圖1。從圖1中分析可見， 三種酶根本在5060 C之間有酶活相對(duì)較高值，具體溫度點(diǎn)差異較大，分別為60

9、 C、50C、55C，在60C至75C，酶活力呈直線下降，約降為到2030%之間?？梢姡瑴囟葘?duì)酶活力影響，特別是高溫對(duì)其有著較大迫害作用。354045505560657075圖1不同溫度對(duì)木聚糖酶的相對(duì)酶活在不同PH條件下影響參數(shù)選擇為：底物濃度0.5%sigma木聚糖，反響時(shí)間30min，溫度50C, PH值范圍為3.57.5,具體見圖2。從圖2中分析可見，三種酶 PH值得在4.55.5之間酶活 相對(duì)較高值，但個(gè)體差異較大，約為10%左右，PH值從5.5到7.0之間，酶活下降趨勢(shì)較大，約為5060%之間，后趨為平穩(wěn)。可見，PH值對(duì)酶活力影響，特別是高PH值對(duì)其有著較大迫害作用。綜合上溫度和P

10、H值兩因素對(duì)木聚糖酶活力的影響分析，判斷為敏感因素，在實(shí)施應(yīng)用過程 中因?yàn)橹饕刂泣c(diǎn)。OOOOOOOOOOO%活酶對(duì)相*ABL：- CPH4.55.56.57.5圖2不同PH對(duì)木聚糖酶的相對(duì)酶活2.3鈣離子濃度對(duì)對(duì)木聚糖酶活力影響鈣離子在啤酒糖化過程中有著重要的作用，也是啤酒中主要的金屬離子之一。 其中鈣離子對(duì)a淀粉酶活力的影響我們以前進(jìn)行了詳細(xì)的研究。在研究中選擇表1中A、B、G三種酶進(jìn)行相關(guān)分析。其中，參數(shù)選擇為：底物濃度0.5%sigma木聚糖，PH6.5，反響時(shí)間30min，溫度為50C,鈣離子添加濃度依次為0、20、40、60、80、100ppm,具體見圖3。在圖中分析中，A酶相對(duì)活

11、力高點(diǎn)為鈣離子濃度20ppm和60ppm B酶相對(duì)活力高點(diǎn)為鈣離子濃度40ppm和80ppm,C酶相對(duì)活力高點(diǎn)為鈣離子濃度40ppm和60ppm,而相對(duì)酶活力低點(diǎn)都為鈣離子濃度0ppm和100ppm,可見在高濃鈣離子與無(wú)鈣溶液對(duì)酶活力都有抑制作用，而在各產(chǎn)品酶活對(duì)鈣離子濃度的差異化上，本研究認(rèn)為是各產(chǎn)品在制備過程中某些參數(shù)與工藝的差異引起的，鈣離子濃度控制20-80ppm可使各木聚糖酶活力發(fā)揮到最正確點(diǎn)。綜合上分析，在實(shí)驗(yàn)的過程中， 需對(duì)鈣離子濃度對(duì)對(duì)木聚糖酶活力影響進(jìn)行試驗(yàn)，尋找鈣離子最正確添加量。o o O10 91 1%活酶對(duì)相ABC三80706050鈣離子ppm204060 80 100圖3鈣離子對(duì)木聚糖酶的相對(duì)酶活總結(jié)在對(duì)木聚糖酶活力以及