核磁共振波譜方法在順磁金屬蛋白紫色震顫菌血紅蛋白中的應(yīng)用

1、核磁共振波譜方法在順磁金屬蛋白_紫色震顫菌血紅蛋白中的應(yīng)用生物物理學(xué)報(bào)第十四卷第三期一九九八年九月ACTABIOPHYSICASINICAVol.14No.3Se.1998p核磁共振波譜方法在順磁金屬蛋白*-紫色震顫菌血紅蛋白中的應(yīng)用*施蘊(yùn)渝夏佑林吳季輝光壽紅劉琴?gòu)埡ｊ?yáng)粱山(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;)中國(guó)科學(xué)院中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,合肥,230026摘要金屬蛋白由于其所帶金屬離子具有未配對(duì)電子而具有順磁性,致使弛豫時(shí)間縮短、譜線加寬(),50Hz以及譜范圍變大,100m,因而具有與抗磁蛋白不同的譜特征。這時(shí)一些常用的2DppNMR實(shí)驗(yàn)方法將失效。本文探索順磁金屬蛋白的幾種NM

2、R實(shí)驗(yàn)方法,如溶劑峰抑制、2DMCOSY、NOESY、1DNOE差譜及SUPERWEFT等,并精心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件使之適用于順磁金屬()蛋白的結(jié)構(gòu)研究。這些實(shí)驗(yàn)方法成功地應(yīng)用于紫色震顫菌血紅蛋白met-VtHb-CN。通過(guò)這些3+實(shí)驗(yàn)找到了與血紅素Fe配位的組氨酸,并完成了該金屬蛋白的順磁位移的共振峰的識(shí)別、活性中Ka p心質(zhì)子間距離的測(cè)量、抗磁性化學(xué)位移及電離常數(shù)值的確定二維譜血紅素配位組氨酸關(guān)鍵詞:順磁金屬蛋白NOE差譜眾所周知,NMR已成為解析生物大分子結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的有力手段。然而許多蛋白質(zhì)含有金屬離子,隨著研究的深入,在解析一些抗磁性蛋白的3D空間結(jié)構(gòu)后,人們的研究興趣又轉(zhuǎn)移到解析順磁金

3、屬蛋白的3D空間結(jié)構(gòu)上來(lái)。因而順磁金屬蛋白的3DNMR結(jié)構(gòu)研究已成為結(jié)構(gòu)研究中的一大熱點(diǎn)。順磁化合物存在未配對(duì)電子。包含未配對(duì)電子的化合物通常含有一個(gè)或幾個(gè)過(guò)渡金屬離子。自由基也是順磁的,包含未配對(duì)的電子,但由于其電子弛豫時(shí)間長(zhǎng),導(dǎo)致核的橫向弛豫時(shí)1間短,譜線加寬嚴(yán)重,因而不適于高分辨率的NMR實(shí)驗(yàn)。金屬蛋白可以是抗磁性的,也可以是順磁性的,這取決于金屬離子的電子排列情況。如與氧或一氧化碳結(jié)合的紫色震顫菌血紅2+()蛋白VtHb-O、VtHb-CO由于其Fe的電子都已配對(duì),就是抗磁性的,總體的電子自旋22+()S=0;而脫氧震顫菌血紅蛋白VtHb,由于其Fe具有四個(gè)未配對(duì)電子,因而總體的電子自

4、3+()旋S=2;而這里將研究的是與氰結(jié)合的正鐵震顫菌血紅蛋白met-VtHb-CN,由于其Fe2只有一個(gè)電子未配對(duì),因而其總體的電子自旋S=1/2;當(dāng)然也還有S=5/2的狀態(tài)。(順磁金屬蛋白的NMR譜的最顯著的特征是順磁中心附近的質(zhì)子共振峰稱(chēng)順磁位移的)(共振峰的位移和加寬。共振峰的位移導(dǎo)致譜范圍的加大。通常,質(zhì)子譜只有10寬,但順mpp()磁金屬蛋白的質(zhì)子譜寬將隨著金屬離子的電子自旋的大小而變化。如低自旋S=1/2氰合正()鐵血紅蛋白met-Hb-CN的質(zhì)子譜寬約為30m,而高自旋S=5/2正鐵血紅蛋白met-pp2Hb的質(zhì)子譜寬可達(dá)100mpp。譜線的寬度也可加寬為幾十、幾百甚至幾千Hz

5、,這取決于觀測(cè)核與順磁中心之間的距離以及金屬離子的自旋狀態(tài),譜線的加寬給高分辨率的NMR譜的獲得帶來(lái)了很大的困難。由于分子量的加大和順磁弛豫,使得磁化矢量衰減加快,2DNMR實(shí)*中法合作項(xiàng)目和安徽省自然科學(xué)基金資助課題通信聯(lián)系人驗(yàn)中的相干轉(zhuǎn)移效率下降,交叉峰減弱,因而給共振峰的識(shí)別帶來(lái)了很大的困難。然而由于順磁弛豫也使自旋-晶格弛豫時(shí)間T縮短,可使用短的實(shí)驗(yàn)恢復(fù)延時(shí),因而便于累加以提高順1（磁位移的信號(hào)的強(qiáng)度。而且由于順磁中心附近的核的共振位置的大幅度的移動(dòng)許多共振峰）將落在抗磁包絡(luò)0?10m外及這些峰的分散,我們可較為容易地識(shí)別它們。即使有些峰落pp（在抗磁區(qū),也可以通過(guò)COSY、NOESY

6、的交叉峰而加以識(shí)別。對(duì)于離順磁中心很近如距離3.5!的核,其譜線加寬嚴(yán)重,相干轉(zhuǎn)移效率極低,看不到交叉峰,這時(shí)可用1DNOE差譜進(jìn)行譜線識(shí)別。本工作精心選擇并設(shè)計(jì)適合于順磁金屬蛋白研究的一些NMR實(shí)驗(yàn)方法,并應(yīng)用于紫色震顫菌血紅蛋白的結(jié)構(gòu)研究,獲得了一些有意義的結(jié)果。1研究方法1.1溶劑峰的抑制生物樣品所用溶劑為水或磷酸鹽緩沖液,這時(shí)質(zhì)子譜將會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)大的溶劑峰。溶劑如果只是水,那么在,4.7m位置將出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)大的水峰;如果溶劑是磷酸鹽緩沖液,那么將可能pp出現(xiàn)兩個(gè)溶劑峰,一個(gè)為出現(xiàn)在,4.7位置的水峰,另一個(gè)出現(xiàn)在,3.6處,它的強(qiáng)mmpppp度小于水峰的強(qiáng)度,但遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)分子的共振峰的強(qiáng)度

7、。為了保持樣品的酸堿性,一般使用磷酸鹽緩沖液作為溶劑,于是出現(xiàn)兩個(gè)溶劑峰。由于強(qiáng)大的溶劑峰影響接收機(jī)的動(dòng)態(tài)范圍,也使得NMR譜的基線扭曲因此要抑制溶劑峰。最簡(jiǎn)單最有效的方法還是預(yù)飽和方法。為了同時(shí)抑制兩個(gè)溶劑峰,可采用雙頻率的預(yù)飽和?，F(xiàn)代的NMR譜儀都具有多個(gè)頻率通道。可用其中的兩個(gè)頻率通道產(chǎn)生兩個(gè)頻率稍有不同（）的如500.132352和500.131794MHz連續(xù)波,然后耦合到一起經(jīng)功放一起放大后加在發(fā)射線圈上。調(diào)節(jié)頻率偏置和功率使對(duì)兩個(gè)溶劑峰的飽和效果最佳。這種雙頻率的預(yù)飽和被插進(jìn)以下各種1D和2DNMR實(shí)驗(yàn)中。1. 22D實(shí)驗(yàn)3 對(duì)于抗磁性蛋白,2DNMR實(shí)驗(yàn)方法可獲得詳細(xì)的溶液結(jié)構(gòu)

8、。這一方法包含兩個(gè)基本的步驟,一是通過(guò)DQF-COSY和TOCSY進(jìn)行自旋系統(tǒng)識(shí)別及獲得J耦合即二面角信息,二是通過(guò)NOESY實(shí)驗(yàn)進(jìn)行順序識(shí)別及獲得質(zhì)子間的距離信息。然而順磁離子的存在,使譜線（）（）,信號(hào)衰減加快,即T變短,6Hz加寬,50ms。我們知道,在COSY或DQF-COSY譜2兀（）（）里,交叉峰的強(qiáng)度正比于sinJtex-t/T。由于J值較小，如取J=7Hz,那么當(dāng)t?1p121（九）（）（71ms時(shí),sinJt才達(dá)最大=1。但由于T較短,ex/T衰減快,一般經(jīng)過(guò)20-t12p12ms兀）（右的時(shí)間，信號(hào)就衰減為零,因而sinJtex-t/T的值很小，亦即交叉峰很弱。這正是生1p

9、12（）物大分子分子量?20kDa和順磁蛋白的COSY譜的一大缺點(diǎn)。另外由于COSY交叉峰是正負(fù)交替的,而順磁蛋白質(zhì)的NMR譜線又較寬,因而COSY的正負(fù)交替的交叉峰將有很大部4 （分被抵消。相反,在順磁蛋白的NMR研究中,為了獲得質(zhì)子間的J耦合關(guān)系,MCOSY幅度）COSY卻表現(xiàn)較好。因?yàn)榧词筂COSY有較強(qiáng)的對(duì)角峰,但是由于我們主要關(guān)心順磁位移的共振峰,它們的化學(xué)位移相差較大,因而其交叉峰遠(yuǎn)離對(duì)角線,MCOSY的較強(qiáng)的對(duì)角峰對(duì)它們沒(méi)有影響。在順磁蛋白的研究中,主要關(guān)心順磁位移的共振峰之間的聯(lián)系,因而可縮短實(shí)驗(yàn)恢復(fù)延393-紫色震顫菌血紅蛋白中的應(yīng)用核磁共振波譜方法在順磁金屬蛋白第3期時(shí),如

10、取100ms。這樣可在相同的時(shí)間內(nèi)增加累加次數(shù),提高順磁部分信號(hào)強(qiáng)度。由于抗磁部分的質(zhì)子弛豫時(shí)間T長(zhǎng),而順磁部分的質(zhì)子的弛豫時(shí)間T短,因而縮短實(shí)驗(yàn)恢復(fù)延時(shí),對(duì)順11磁部分的信號(hào)沒(méi)有大的影響,卻可以大大降低抗磁部分信號(hào)的強(qiáng)度,即起到加強(qiáng)順磁部分信號(hào)壓制抗磁部分信號(hào)的作用。使用短的實(shí)驗(yàn)恢復(fù)延時(shí)的抗磁信號(hào)與順磁信號(hào)的比,相對(duì)于使用長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)恢復(fù)延時(shí)的同一比值,可以降低10-15倍。順磁蛋白的MCOSY實(shí)驗(yàn)的譜寬應(yīng)該設(shè)A置得寬一些。因?yàn)樽V寬大，步長(zhǎng)t短，就能保證取得的所有fid都有較大的強(qiáng)度,這樣就有較1強(qiáng)的交叉峰。相反,譜寬越窄,交叉峰越弱。在抗磁蛋白研究中所廣泛使用且發(fā)揮重要作用的TOCSY實(shí)驗(yàn),在

11、這里卻很難發(fā)揮其作用。這是因?yàn)樵赥OCSY中有一段均勻混合期,本來(lái)就由于譜線較寬而嚴(yán)重衰減的信號(hào)再進(jìn)一步衰減,因而TOCSY譜的交叉峰非常弱,只能看到很少的交叉峰。5 在順磁蛋白的NOESY譜里,具有較強(qiáng)的交叉峰。這是因?yàn)樵贜OESY譜里,交叉峰強(qiáng)（九）（）（）（冗）度正比于cosJtex-t/T,這樣即使ex-t/T存在衰減,但cosJt取值較大1p12p121（冗冗）Jt<</2,于是有較強(qiáng)的交叉峰。而且由于NOESY交叉峰都是同相的,因而也不會(huì)出現(xiàn)1rCOSY譜中的那種正負(fù)抵消。這里同樣可設(shè)置實(shí)驗(yàn)恢復(fù)延時(shí)為100ms,而混合延時(shí)可?。ň牛?0-30ms。由于NOESY譜的交叉

12、峰在t期間的調(diào)制cosJt,不同于MCOSY的調(diào)制sin11（九）Jt,因而NOESY的譜寬對(duì)NOESY交叉峰的強(qiáng)度的影響沒(méi)有MCOSY中那樣嚴(yán)重。因1此,如果將NOESY譜寬設(shè)置為10m,這時(shí)也可獲得較好的NOESY譜,在抗磁區(qū)里的順磁pp位移的共振峰的交叉峰也清晰可見(jiàn)。1.31DTOE差譜5 ）（TOETruncatedOverhauserEffect差譜可用于測(cè)量鄰近核之間的NOE關(guān)系。在瞬態(tài)NOE實(shí)驗(yàn)里,為了避免自旋擴(kuò)散使用較短的混合時(shí)間,因而只能產(chǎn)生較弱的NOE差信號(hào)。然而在TOE實(shí)驗(yàn)里,即使使用較長(zhǎng)的混合時(shí)間也只有較小的自旋擴(kuò)散于是混合時(shí)間的延長(zhǎng)使 得N O E差信號(hào)也增強(qiáng)，并且沒(méi)

13、有或只有較小的自旋擴(kuò)散。這里必須使用三個(gè)頻率通道，兩個(gè)通道用于預(yù)飽和溶劑峰，一個(gè)通道用于照射某一被考察質(zhì)子的共振，以便通過(guò)NOE增強(qiáng)而識(shí)別與被照射質(zhì)子附近的質(zhì)子。CNBa1.4SUPERWEFT實(shí)驗(yàn)Ba在順磁蛋白的質(zhì)子譜里有三類(lèi)信號(hào)：一是溶504劑信號(hào)，其弛豫時(shí)間較長(zhǎng)，如T約為1sec ; 其次1 6 3是抗磁部分質(zhì)子即遠(yuǎn)離順磁中心的質(zhì)子的信號(hào),FeTa它們的T約為300ms;最后是順磁部分即順磁中16()心附近的質(zhì)子的信號(hào)即順磁位移的共振峰，這a27186a些質(zhì)子的T較短，約為30 m sSU P ER W E F T 實(shí) 16 B驗(yàn)就是利用這三類(lèi)信號(hào)弛豫時(shí)間的不同以便消N432除溶劑峰、降

14、低抗磁包絡(luò)而突出順磁部分信號(hào)的。SUPERWEFT實(shí)驗(yàn)脈沖序列即為測(cè)量T的1NHis85a冗冗冗翻轉(zhuǎn)-恢復(fù)序列,d-d-/2-AQ,這里、12B()StructureofhemeAandFi.1coor2g冗冗冗/2即為、/2脈沖，d、d為延時(shí)，AQ為取數(shù)123+dinationofitsFe.時(shí)間。調(diào)劑d、d和AQ就可達(dá)到消除溶劑峰、降12低抗磁包絡(luò)而突出順磁部分信號(hào)的目的。1.5順磁部分質(zhì)子間距離的測(cè)量()對(duì)于血紅素及其鄰近殘基如配位組氨酸中的質(zhì)子,它們的自旋-晶格弛豫時(shí)間主要來(lái)自于順磁弛豫,因此對(duì)于這些核,通過(guò)自旋-晶格弛豫時(shí)間的測(cè)量可獲得活性中心的結(jié)構(gòu)信7,8息。它們的自旋-晶格弛豫時(shí)

15、間由下式確定,61/r()1/Ti1?1i3+其中ri為觀測(cè)核i與順磁中心Fe之間的距離。于是對(duì)于兩個(gè)不同的質(zhì)子i、,有j66()=r/rT/2Ti1i1jj3+7,83+(),那么別的核到Fe的距離就!假設(shè)血紅素的3CH質(zhì)子見(jiàn)Fi到Fe的距離為6.1.13g可由上式得出。1.6抗磁性化學(xué)位移的確定前已敘述,同一種金屬蛋白既可以是順磁性的,也可以是抗磁性的,這唯一地取決于金屬6離子的電子排列。順磁蛋白的質(zhì)子的化學(xué)位移由兩部分組成：一是原有的抗磁性蛋白的相應(yīng)6質(zhì)子的化學(xué)位移，這部分稱(chēng)抗磁性化學(xué)位移；二是由順磁中心與所考察質(zhì)子的Fermi接觸dia()()相互作用產(chǎn)生接觸化學(xué)位移和偶極相互作用產(chǎn)生

16、假接觸化學(xué)位移產(chǎn)生的順磁性化學(xué)位移Ka+()AHA+H?46。順磁性化學(xué)位移與溫度T成反比,因此arap66()66=+=+k/3Tdiadiaarap于是通過(guò)變溫實(shí)驗(yàn)及化學(xué)位移對(duì)溫度的線性擬合,就可獲得每一個(gè)質(zhì)子的抗磁性化學(xué)位9移。電離平衡常數(shù)Ka的確定1.7p對(duì)于一結(jié)合-解離平衡,()為了獲得其電離平衡常數(shù)對(duì)化學(xué)位移進(jìn)行H滴定。對(duì)于方程4所示的單電離系Ka,pp10()統(tǒng),化學(xué)位移數(shù)據(jù)可由方程5來(lái)進(jìn)行擬合,即(H)Ka-p-p10"6(6)obsnan=+-()5(H)Ka-p-p110+()666其中、分別為4式中的A、AH+中的某一質(zhì)子的化學(xué)位移，則是A和AH中同一質(zhì)naob

17、s子由于快速交換而觀測(cè)到的化學(xué)位移的加權(quán)平均值。于是通過(guò)擬合就可獲得Ka值。p2應(yīng)用紫色震顫菌血紅蛋白VtHb是在細(xì)菌中已鑒別的第一個(gè)血紅蛋白。VtHb具有146個(gè)殘基,分子量為15775。它由一在缺氧條件下生長(zhǎng)的嚴(yán)格需氧微生物Vitreoscilla分泌,它的結(jié)構(gòu)11類(lèi)似于真核血紅蛋白的結(jié)構(gòu)。VtHb可以改善微生物對(duì)溶解氧的利用,促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)及其某些次級(jí)代謝物的合成。VtHb的結(jié)構(gòu)研究,無(wú)論是在理解它的功能方面還是在為了探索生物的進(jìn)化過(guò)程而比較原核和真核的差異方面，都具有非常重要的理論意義。在1997年，Tarri212coneC.等已獲得了met-VtHb及VtHb-N的晶體結(jié)構(gòu)，但有關(guān)

18、NMR方面的研究工3作還未曾開(kāi)始。特別是，對(duì)于與鼠結(jié)合的紫色震顫菌血紅蛋白VtHb-CN,既無(wú)晶體結(jié)構(gòu)也無(wú)395-紫色震顫菌血紅蛋白中的應(yīng)用核磁共振波譜方法在順磁金屬蛋白第3期A.H2Osolution3020100mppB.H2OsolutionN1H3020100mppC.D2Osolution8cH33cH34Hc04Ht07Ha1NHa7H24HaH2H100C2H4Ha(aC)N1HH,6.8ppm6H1-meso6H1"0m2030pp101sectraNMRofmet-VtHb-cNatFi.2302K.A.H2OHpgsolutionwithout,B.H2Osolu

19、tionwithresaturationdouble-freuencpqyc.D2Osolutionwithdouble-resaturation,freuencresaturation.pqypExperimentalrecoverydelay,100ms;numberofscans,1K.NMR的溶液結(jié)構(gòu)。這里將用上面所敘述的方法對(duì)正鐵低自旋氰合紫色震顫菌血紅蛋白()met-VtHb-cN,S=1/2進(jìn)行研究,一方面探索順磁金屬蛋白的NMR研究方法,另一方面通過(guò)這些研究方法獲得紫色震顫菌血紅蛋白的活性中心的結(jié)構(gòu)信息。3+紫色震顫菌血紅蛋白包含一個(gè)血紅素。血紅素中的Fe是六配位的,除了與血紅

20、素中的(四個(gè)N原子配位外,還與-cN及組氨酸His85的咪唑環(huán)的3號(hào)位氮原子配位如Fi所.1g1)H示。Fi.2為met-VtHb-cN的1DNMRHO g 2譜,其中A和B為met-VtHb-cNmpp22,23MCOSY2814274-70161312231517343532221032833302720303020100mppmet-VtHb-CNinD2O,Fi.3MCOSYof7.2at302K.HExeri2gppmental100ms;numberofscans,1K.recoverdela,Double-freuencyyqytoresaturationisusedinorde

21、rsuresssolventeaks.Theinsertsatleftppppare22,23and28,27.RefertoofuartexansionsofeakscationpppppthelabelsofFi.4foreaks.gp溶液的NMR譜,C為met-VtHb-CN的DO溶液的NMR譜。在A中,由于沒(méi)有使用預(yù)飽2和,可看到兩個(gè)強(qiáng)大的溶劑峰;在B、C中使用雙頻率的預(yù)飽和,溶劑峰得到了很好的抑制。在室溫下,met-VtHb-CN的質(zhì)子共振峰分布在-10?32m范圍。其中0?10m范圍為pppp抗磁包絡(luò),對(duì)應(yīng)于抗磁性蛋白的質(zhì)子共振區(qū)域。當(dāng)然也有一些順磁部分的共振峰落在抗磁區(qū)。在高場(chǎng)0

22、?10和低場(chǎng)10?32區(qū)域的共振峰為順磁位移的共振峰。mmpppp為了識(shí)別順磁中心附近質(zhì)子的共振,進(jìn)行2DMCOSY和NOESY實(shí)驗(yàn)。MCOSY和NOESY的譜寬在兩維都取60FT后的譜由1024*1024個(gè)點(diǎn)組成。每一個(gè)fid累加m,2Dpp1024次。MCOSY的原始fid數(shù)據(jù)由256*1024個(gè)點(diǎn)組成,而NOESY則由512*1024個(gè)點(diǎn)組成。實(shí)驗(yàn)恢復(fù)延時(shí)取100ms,都采用雙頻率的預(yù)飽和以便抑制溶劑峰。Fi.3為met-VtHb-CN的MCOSY譜。在MCOSY中,可識(shí)別5個(gè)自旋系統(tǒng),即血紅g素上的7、6丙酸基,4、2乙烯基及配位組氨酸His85。由實(shí)線連接的交叉峰產(chǎn)生于血紅素中每?jī)蓚€(gè)

23、J耦合質(zhì)子間的相干轉(zhuǎn)移,而虛線連接的交叉峰產(chǎn)生于配位組氨酸His85。Fi.3中左上g角的兩個(gè)插圖是交叉峰22、23及27、28的擴(kuò)展,它們分別來(lái)自于4、2乙烯基。由以虛線連接的COSY圖形可識(shí)別配位組氨酸的Ha,兩個(gè)H和NH。這里各共振峰的識(shí)別方法可參考文獻(xiàn)B397-紫色震顫菌血紅蛋白中的應(yīng)用核磁共振波譜方法在順磁金屬蛋白第3期mpp282127254-714260161329128151191710181920103533334323031202422,23NOESY30302010m0ppNOESYofFi.4met-VtHb-CNinD2O,H7.2at302K.Exerimental

24、gppscans,1K.recoverdela,100ms,numberofDouble-freuencresaturationyyqyp1 susedinordertosolventtimeis30ms.Thecrosssuresseaks.Mixinpppgofinterestarelabeledwithnumberto:Intrahemecrosseaksaccordinpg(aa)(aa)(aaeaks:1,28cH3:7H1,8cH3:7H2,37H1:7H2,4-77H1,7H2:7H1,p0)(aaYYaa)(a)(7H2,8,97H1,7H2:-meso-H,10,11-mes

25、o:6H1,6H2,126H1:0a)()(a)(a)(a)6H1,136H2:6H1,146H1:6H1,156H1:6H2,166H2:6H1,17"0"()(6H2:a)(a)()(6H1,21-6H2,185cH3:6H1,195cH3:-meso,205CH3:MM)(a)(a)(a)meso:4Ht,22,234H:4Ht,4Hc,244H:3CH3,253CH3:-meso,26MP(aaa)(a)()(2H:-meso,272H:2Hc,282H:2Ht,292Hc:2Ht;IntraHis85MM()(a)()()(crosseaks:30H1:H2,31

26、H1:NH,32H1:H,33H2:NH,34H2:pMMMa)(a)H,35NH:H.()4。使用30ms混合時(shí)間的met-VtHb-CN的NOESY譜示于Fi.4。MCOSY中的交叉g峰在這里清晰可見(jiàn)，而且出現(xiàn)許多新的交叉峰。結(jié)合已識(shí)別的MCOSY中的交叉峰和NOESY中新出現(xiàn)的交叉峰，幾乎可識(shí)別血紅素和配位組氨酸中所有的共振峰。()()由文獻(xiàn)8和9得知，處在-7.8m的寬峰產(chǎn)生于配位組氨酸的咪晚環(huán)的CH。由于pp2CH接近順磁中心，因此產(chǎn)生較大的順磁位移和較強(qiáng)的順磁弛豫。由于CH共振峰強(qiáng)度小，不22可能在NOESY譜中看到它與其鄰近質(zhì)子間的交叉峰。因而只能用TOE差譜來(lái)尋找它們之()C4

27、H,10mppH1BC2HC2H3020100mpp3020100mppTOEdifferenceofmet-Fi.5sectrumgpVtHb-CNinD2Oat302Kwithirradiating1C2Hat-7.8m.ExerimentalrecoverpppyHNMRofmet-Fi.6spectrumgCW,100dela,400ms;irradiatintimeofVtHb-CNinD2Oat302Kacuiredygqms;irradiatinowerlevel,55dB;andac2withSUPERWEFTmethod.1=83.2dgpms,d2=81ms,AQ=34.8

28、6ms.cumulatingnumber,32X2000.（、功率為55dB-ms間的聯(lián)系。met-VtHb-CN的TOE差譜示于Fi.5。用一長(zhǎng)度為100g）（6dB對(duì)應(yīng)于100W的連續(xù)波照射-7.8處的寬峰,可得到在17.42在MCOSY中mmpppp）已識(shí)別,為配位His85的H質(zhì)子處的一個(gè)負(fù)的NOE差信號(hào)。由此可說(shuō)明在-7.8m處的1ppB共振峰確為配位組氨酸的咪唑環(huán)的CH。2配位組氨酸的咪唑環(huán)上的CH也接近順磁中心,也產(chǎn)生較寬的共振峰。我們用SUPER24WEFT實(shí)驗(yàn)來(lái)尋找該共振峰。當(dāng)d、d和AQ分別取83.2ms、81ms和34.86ms時(shí),有較好12的效果。Fi即為met-VtH

29、b-CN的SUPERWEFT譜,從該圖可看到兩個(gè)清晰的寬峰,.6g（處在-7.8m的為CH共振峰,而處在10m的則為C4H共振峰。在Fi.6中,溶劑峰被pp2ppg抑制掉了,抗磁包絡(luò)和一些順磁部分的共振峰也受到了不同程度的壓制。而離順磁中心最近（的兩個(gè)質(zhì)子,即配位組氨酸His85的咪唑環(huán)的CH和CH,由于它們的T可用翻轉(zhuǎn)-恢復(fù)法241）測(cè)得只有4.2ms,因而它們的縱向磁化在較短的延時(shí)d、d里已完全恢復(fù)到最大值,信號(hào)沒(méi)12有得到抑制,于是它們的共振峰相對(duì)于別的共振峰就得到了加強(qiáng),也就清晰地顯露出來(lái)了。為了得到活性中心中各質(zhì)子到順磁中心的距離,用翻轉(zhuǎn)-恢復(fù)法測(cè)量它們的自旋-晶格3+()弛豫時(shí)間。

30、然后由2式就可獲得被觀測(cè)質(zhì)子到順磁中心Fe的距離。如配位組氨酸His85的3+兩個(gè)H、NH和咪唑環(huán)的CH到Fe的距離分別為5.8、6.0、6.2和3.5!,其它一些鄰近質(zhì)2B3+子到Fe的距離也可類(lèi)似地測(cè)得。通過(guò)變溫實(shí)驗(yàn)可獲得順磁蛋白的順磁部分質(zhì)子的抗磁性化學(xué)位移。順磁部分質(zhì)子的化學(xué)位移隨溫度的變化是線性的,其截距即為對(duì)應(yīng)的抗磁性化學(xué)位移。通過(guò)擬合可得所有順磁部分質(zhì)子的抗磁性化學(xué)位移都落在0?11m范圍。pp電離平衡常數(shù)是一個(gè)很重要的物理量,它能反映所測(cè)電離平衡反應(yīng)的帶電環(huán)境。通Kap過(guò)化學(xué)位移的H滴定,可獲得電離平衡常數(shù)Ka值。配位組氨酸的咪唑環(huán)在溶液的酸堿性發(fā)pp()生變化時(shí),就會(huì)產(chǎn)生質(zhì)子

31、化或去質(zhì)子化反應(yīng)。通過(guò)化學(xué)位移的H滴定和5式的擬合,可獲得p配位組氨酸的咪唑環(huán)的電離平衡常數(shù)為4.95。這一值小于自由組氨酸的值KaKaKappp()()6.59和沒(méi)有配位的組氨酸殘基的值5.88-8.05。由于正電環(huán)境使值減小,負(fù)電KaKapp環(huán)境使值增加,由此可推測(cè)這里的配位His85的咪唑環(huán)處在一正電環(huán)境。顯然這是由帶Kap3+正電的Fe及咪唑環(huán)與之配位造成的399-紫色震顫菌血紅蛋白中的應(yīng)用核磁共振波譜方法在順磁金屬蛋白第3期3結(jié)論順磁金屬蛋白的NMR譜具有譜范圍大、譜線寬的特點(diǎn),這給NMR譜的解析帶來(lái)了一定的困難。但是只要精心地選擇實(shí)驗(yàn)方法和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件,還是可以對(duì)順磁位移的共振峰加

32、以識(shí)別并獲得許多重要的信息。在順磁蛋白的NMR研究中MCOSY、NOESY較為有效。為了降低抗磁包絡(luò),不論1D、2D實(shí)驗(yàn),均使用較短的實(shí)驗(yàn)恢復(fù)延時(shí)。TOE和SUPERWEFT在尋找較弱的順磁位移的共振峰及這些峰與別的共振峰的聯(lián)系時(shí),能發(fā)揮很好的作用。這些方法已成功地應(yīng)用于紫色震顫菌血紅蛋白met-VtHb-CN的NMR研究中。由這些方法識(shí)別了3+血紅素及配位組氨酸的共振峰,得到了血紅素和配位組氨酸中的質(zhì)子到順磁中心Fe的距離。通過(guò)變溫和滴定實(shí)驗(yàn)也得到了順磁位移的共振峰的對(duì)應(yīng)的抗磁化學(xué)位移及配位組氨Hp酸的電離平衡常數(shù)。Kap參考文獻(xiàn)1 I.Bertini,P.Turano,andA.J.Vil

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