SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量實驗報告

1、SD& PAG E測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量 、廣 4 i一、前言聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡稱PA GE,就是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)得一種常用電泳技術(shù)。 聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺聚合而成,聚合過程由自由基催化完成。催化聚合得常用方法有兩種：化學聚合法與光聚合法?；瘜W聚合以過硫酸鏤（A P S）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，T EMED 催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基,后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合,同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)， 從而形成三維網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)。PAGE 根據(jù)其有無濃縮效應(yīng),分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，

2、連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH 值及凝膠濃度相同 ,帶電顆粒在電場作用下， 主要靠電荷與分子篩效應(yīng)。 不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分 ,pH, 凝膠濃度及電位梯度得不連續(xù)性,帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng),還具有濃縮效應(yīng),因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。 不連續(xù)體系由電極緩沖液、 濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠就是由AP催化聚合而成得大孔膠，凝膠緩沖液為p H6、 7得Tris-HC 1。分離膠就是由A P催化聚合而成得小孔膠，凝膠緩沖液為pH 8、9 Tri s -HCl.電極緩沖液就是pH8、3 Tris甘氨酸緩沖液.2種孔徑得凝膠、2種緩沖體系、3種p H值使不連續(xù)體

3、系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分得不連續(xù)性，這就是樣品濃縮得主要因素.S DS就是陰離子去污劑，作為變性劑與助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)與分子間得氫鍵,使分子去折疊，破壞蛋白分子得二、三級結(jié)構(gòu)。而強還原劑如巰基乙醇,二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間得二硫鍵斷裂。在樣品與凝膠中加入還原劑與 SDS 后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后得氨基酸側(cè)鏈與S DS結(jié)合成蛋白SDS膠束，所帶得負電荷大大超過了蛋白原有得電荷量,這樣就消除了不同分子間得電荷差異與結(jié)構(gòu)差異。SDS-PAGE 一般采用得就是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，與連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比,能夠有較高得分辨率.濃縮膠得作用就是有堆積作用，凝膠濃度較小 ,孔徑較大，把

4、較稀得樣品加在濃縮膠上， 經(jīng)過大孔徑凝膠得遷移作用而被濃縮至一個狹窄得區(qū)帶。當樣品液與濃縮膠選TRIS/HCl緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后,HCl解離成氯離子，甘氨酸解離出少量得甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快 ,甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大超過蛋白， 因此在后面形成低電導區(qū)， 而電場強度與低電導區(qū)成反比因而產(chǎn)生較高得電場強度，使蛋白與甘氨酸根離子迅速移動 ,形成一穩(wěn)定得界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層 .此鑒定方法中，蛋白質(zhì)得遷移率主要取決于它得相對分子質(zhì)量，而與所帶電荷與分子形狀無關(guān) .聚丙烯酰胺凝膠電

5、泳作用原理聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有分子篩效應(yīng)它有兩種形式:非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Nati vePAGE）及SDS一聚丙烯酰胺凝 膠（SD S-P AGE）;非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳得過程中，蛋白 質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)， 并依據(jù)蛋白質(zhì)得分子量大小、 蛋白質(zhì)得形狀及 其所附帶得電荷量而逐漸呈梯度分開。而SDS PAGE僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量得不同就可以分開蛋白質(zhì)。該技術(shù)最初由shapi r o于196 7年建立，她們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)與丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑與強還原劑（ SDS 即十二烷基硫酸鈉）后 ,蛋白質(zhì)亞基得電泳遷移率主要取決于亞基分子量得大?。梢院雎噪姾梢蛩?） 。二、實驗

6、目得1、學習S D S-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量得原理.2 、掌握垂直板電泳得操作方法。3、運用S D S PAGE測定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。三、實驗原理1、電泳帶電顆粒在電場作用下,向著與其電荷相反得電極移動得現(xiàn)象。在一定得電場強度下 ,分子在凝膠介質(zhì)中得遷移速率取決于分子得大小、構(gòu)型與帶電量得大小 .2、PAGE聚丙烯酰胺凝膠（PAG）就是由單體丙烯酰胺（Acr）與交聯(lián)劑甲叉 雙丙烯酰胺（Bi s）在加速劑四甲基乙二胺（TEMED）與引發(fā)劑過硫酸 鏤(AP)得作用下聚合交聯(lián)而成得三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)得凝膠。以此凝膠 作為支持介質(zhì)得電泳稱為 PAG E.PAGE具有電泳與分子篩得雙重作 用。PAG

7、機械強度好，有彈性,透明，化學性質(zhì)穩(wěn)定，改變Acr濃度或 Acr 與 Bis 得比例可以得到不同孔徑得凝膠。PAGE分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液 pH 值與凝膠中得相同、帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷與分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。3、SDSPAGE基本原理S D S P AGE就是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS與含有琉基乙醇得樣品處理液， SDS 就是一種很強得陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)與分子間得氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子得二級與三級結(jié)構(gòu)。強還原劑巰基乙醇可以斷開二硫鍵

8、破壞蛋白質(zhì)得四級結(jié)構(gòu) .使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子.解聚后得側(cè)鏈與S DS充分結(jié) 合形成帶負電荷得蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS 陰離子后，所帶負電荷得量遠遠超過了它原有得凈電荷,從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷得差異。蛋白質(zhì)得電泳遷移率主要決定于亞基得相對分子質(zhì)量。 而與其所帶電荷得性質(zhì)無關(guān)。當?shù)鞍踪|(zhì)得分子量在 1 7 , 00016 5 ,00 0之間時,蛋白質(zhì)一SS 復(fù)合物得電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量得對數(shù)呈線性關(guān)系lgMW = K bm將已知分子量得標準蛋白質(zhì)在 SD S- PAG E中得電泳遷移率對分子量得對數(shù)作圖， 即可得到一條標準曲線。 只要測得未知分子量

9、得蛋白質(zhì)在相同條件下得電泳遷移率,就能根據(jù)標準曲線求得其分子量.四、實驗器材與材料試劑儀器:垂直板型電泳梢；直流穩(wěn)壓電源；50或10 0山微量注射器、 玻璃板、水浴鍋，染色槽；燒杯;吸量管;常頭滴管等。原料:低分子量標準蛋白質(zhì)按照每種蛋白0、5-1mgml -1樣品溶解液配制 可配制成單一蛋白質(zhì)標準液， 也可配成混合蛋白質(zhì)標準 液試劑：(1 )分離膠緩沖液(Tris H C 1緩沖液PH8、9):取1 mol/L鹽酸4 8mL,T r is 36、3 g ,用無離子水溶解后定容至 100m L;(2)濃縮膠緩沖液(Tr 1 s-HCl緩沖液 PH 6、7):取1mol/ L鹽酸4 8mL ,

10、T r is 5、98 g，用無離子水溶解后定容至 10 0m L;(3)3 0 %分離膠貯液：配制方法與連續(xù)體系相同，稱丙烯酰 胺(Acr) 3 0g&N, N'-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0、8g,溶于重蒸水中, 最后定容至100m 1 ,過濾后置棕色試劑瓶 中,4保存；(4)10 %濃縮膠貯液：稱Ac r10 g及Bis 0、5g,溶于重蒸 水 中，最后定容至10 0mL,過濾后置棕色試劑瓶中，4貯存;(5 )10% S DS溶液：S DS在低溫易析出結(jié)晶，用前微熱，使其完全溶解；(6)1%TEMED;(7)10%過硫酸鏤(AP ):現(xiàn)用現(xiàn)配;(8)電泳緩沖液(Tris一甘

11、氨酸緩沖液PH8、3):稱取Tr is 6、0g,甘氨酸28、8g, SDS 1、0g,用無離子水溶解后定容 至1L;(9)樣品溶解液：取SDS lOOmg,航基乙醇0、1mL, 甘油1mL,澳酚藍2mg,0、2 m o 1 /L,p H 7、2磷酸緩沖液0、5mL, 加重蒸水至10 mL (遇液體樣品濃度增加一倍配制)。用來溶解標準 蛋白質(zhì)及待測固體；(10)染色液：0、25g考馬斯亮藍 G250,加入4 5 4mL 5 0 %甲醇溶液與46 mL冰乙酸即可；(1 1)脫色液:75mL冰乙酸，875mL重蒸水與5 0 mL甲醇 混勻。五、實驗操作1、制膠玻板得清洗用海綿與洗滌劑輕柔地清洗，嚴

12、禁使用刷子與顆粒狀得去污粉與 洗衣粉，完全沖洗干凈后烘干.2、垂直板電泳梢分離膠得制備配制 12% 分離膠。在燒杯中依次加入重蒸水3 、 35ml, 分離膠緩沖液（1、5mol /L T r i s HC 1 , pH 8、8 ） 2、5 ml , 10% S DS 0、1 m 1 ,凝膠儲備液4、0 m 1 , 1 0 %過硫酸鏤50ul與T E MED 10ul.由于AP與TEM E D相遇后凝膠即開始聚合，所以應(yīng) 立即混勻混合液， 用移液槍抽取凝膠液加至長、 短玻璃板間得窄縫內(nèi)，留出梳齒得齒高加 1cm 得空間停止灌膠,小心覆蓋一層蒸餾水,37 烘箱下聚合（約3 0 min）。待分離膠聚

13、合完全后，除去覆蓋得蒸儲水。濃縮膠得制備配制5%濃縮膠。在燒杯中依次加入重蒸水 2、9 2ml,濃縮膠緩 沖液（0、5mol/L Tr i sHCl,pH6、8） l、25ml, 10% S D S 0、05m 1 ,凝膠儲備液0、8 m 1 ,10% 過硫酸鏤25ul與TEM ED 1 0ul。由于AP與TEMED相遇后凝膠即開始聚合 所以應(yīng)立即 混勻混合液,用移液槍抽取凝膠液加至長、短玻璃板間得窄縫內(nèi),灌滿后小心插入梳齒，避免混入氣泡，3 7C烘箱下聚合（約30 m in）。4、蛋白質(zhì)樣品得處理標準蛋白質(zhì)樣品得處理低分子量標準蛋白試劑盒：兔磷酸化酶BMW= 9 7,400牛血清白蛋白MW=

14、66,200 ?牛碳酸酐酶 MW= 3 1 , 000?胰蛋白酶抑制劑MW= 2 0,100雞蛋清溶菌酶MW=14,40 0 ?開封后，沸水浴中加熱3 5min后上樣。樣液得準備用移液槍小心吸取處理好得血清5 0 ul至1、5ml得離心管中, 再加入50ul上樣緩沖液，混勻后沸水浴中加熱3 mi n ,取出冷卻后 加樣。5 、加樣用移液器分別取51樣品液，小心將樣品加到凝膠凹形樣品梢底部。6、電泳將電泳儀得正負極與電泳槽正負極相連接， 打開電泳儀開關(guān)， 設(shè) 置電壓為20 0 V,電泳6 0m 1 n s,此時澳酚藍染料達到凝膠底部， 停止電泳 ,關(guān)閉電源 .7 、染色與脫色電泳結(jié)束后,取下玻板

15、，在自來水下用特制板撬開短玻璃板,從凝膠板上切下一角作為加樣標記,在兩側(cè)溴酚藍染料區(qū)帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。加入染色液染色60 mi n s,再用脫色液脫色，直至 蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰,即可計算相對遷移率。8 、結(jié)果處理量出加樣端距細銅絲間得距離(cm) 以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心 與加樣端得距離(cm),按下式計算相對遷移率m R:蛋白質(zhì)樣品在移距離（cm） mR二溪粉藍區(qū)帶距加樣端距離（cm） 六、實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)處理1、實驗現(xiàn)象：脫色結(jié)束后，經(jīng)觀察可知 點有mak e r得孔跑出來得有5個清晰 筆直得條帶，遷移率由低到高排列這5個條帶分別就是分別就是兔磷 酸化酶B、牛血清白蛋白、牛碳酸酊酶

16、、胰蛋白酶抑制劑、雞蛋清溶 菌酶。點有血清蛋白得點樣孔跑出得結(jié)果在分離膠與濃縮膠交界處出 現(xiàn)一大團成分未知著色團，經(jīng)老師講解并且上網(wǎng)查閱資料得知這種現(xiàn) 象可能就是所謂得“鬼帶”現(xiàn)象.“鬼帶”就就是在跑大分子構(gòu)象復(fù) 雜得蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）得一些大 分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀。出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要由于還原劑在 加熱得過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離得蛋白質(zhì)分子重新 折疊結(jié)合與亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大， 有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同得免疫學活性，在WB 反應(yīng)中可見其能與目標條帶對應(yīng)得抗體作用。處理辦法為：在加熱煮沸后,再添

17、加適量得DTT或Be t a航基乙醇，以補充不足得還原劑；或 可加適量EDTA來阻止還原劑得氧化.除此之外還觀察到存在“拖尾現(xiàn)象”。這主要就是樣品融解效果 不佳或分離膠濃度過大引起得.處理辦法：加樣前離心；選擇適當?shù)脴?品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。2、實驗數(shù)據(jù)處理澳酚藍區(qū)帶距加樣端距離：5、4 5cm待測樣品遷移距離：5、18cm遷移距離（cm）2、182、7 83、124、035、09遷移率m0、400、5 10、570、740、93MW9 741g MW4、994、824、494、304、16由公式:1 g MW=K bm可得:MW 10 9 6

18、 5即:l g MW= 5、55 1 6 1、 5 8 67m當 m=5、18/5、 4 5= 0、 95 時,lgMW=5、 2 7,貝U：因此待測樣品得相對分子質(zhì)量約為1 0 9 65.七、思考題1、在上樣緩沖液中 SDS、航基乙醇、甘油及澳酚藍得作用分 別就是什么 ?答：SDS使蛋白質(zhì)變性，用于確定蛋白分子量得聚丙烯酰胺凝膠電泳， 也可以用于核酸抽提操作中破壞細胞壁及裂解核酸蛋白復(fù)合物，在乳液聚合反應(yīng)中,可充當兩相溶液得乳化劑;巰基乙醇用于打開二硫鍵得,使蛋白質(zhì)得四級或三級結(jié)構(gòu)被破壞；甘油使樣品處于下面，不易飄起,并有保護作用;溴酚藍用于顯色。2、在S DS-PAGE中，分離膠中得TEM

19、 ED與A P得作用就是什 么?答：過硫酸鏤(A P)為催化劑，四甲基乙二胺(TEMED )為加速劑。 在聚合過程中，TEMED催化過硫酸鏤產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺 單體聚合,同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián),從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。3 、樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘 ?答：樣品液在沸水中加熱以除掉混在其中得一些小亞基,以免影響跑膠效果。八、實驗注意事項1、不就是所有得蛋白質(zhì)都能用S D S -凝膠電泳法測定其分子 量， 已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測出得分子量就是不可靠得。 包括 : 電荷異?；驑?gòu) 象異常得蛋白質(zhì),帶有較大輔基得蛋白質(zhì)(如 某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白

20、如膠原蛋白等。例如組蛋白F1,它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例得SDS,仍不能完全掩蓋其原 有正電荷得影響，它得分子量就是 2 1 ,00 0 ,但SDS凝膠電泳測 定得結(jié)果卻就是3 5, 0 0 0。因此，最好至少用兩種方法來測定未 知樣品得分子量,互相驗證。2、有許多蛋白質(zhì)，就是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如 -胰凝乳蛋白酶）組成得，它們在 SDS與航基乙醇得作用下，解離 成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì),SDS-凝膠電泳測定得只就是它們得亞基或單條肽鏈得分子量,而不就是完整分子得分子量。 為了得到更全面得資料， 還必須用其它方法測定其分子量及分子中肽鏈得數(shù)目等,與 SDS- 凝膠電泳