蛋白質(zhì)工程第四講 分離純化與分析解析

1、第四講第四講 分離純化與分析分離純化與分析一、分離純化是分析的重要過(guò)程：一、分離純化是分析的重要過(guò)程：針對(duì)針對(duì)分析目的分析目的不同，對(duì)分析對(duì)象的不同，對(duì)分析對(duì)象的要求要求和采取的和采取的措施措施不同。不同。u若分析過(guò)程干擾很小，特異性很高，不需要對(duì)樣品處理可直接測(cè)定。如：若分析過(guò)程干擾很小，特異性很高，不需要對(duì)樣品處理可直接測(cè)定。如：抗原及其抗體檢測(cè)，配體及其配基等。抗原及其抗體檢測(cè)，配體及其配基等。u多數(shù)樣品常常需要處理，才能滿足檢測(cè)的要求。如：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、多數(shù)樣品常常需要處理，才能滿足檢測(cè)的要求。如：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、動(dòng)力學(xué)（變復(fù)性）分析、酶學(xué)性質(zhì)研究等，純度要求很高、避免干擾分動(dòng)力學(xué)（

2、變復(fù)性）分析、酶學(xué)性質(zhì)研究等，純度要求很高、避免干擾分析。析。為了為了保證分析保證分析的準(zhǔn)確度，的準(zhǔn)確度，避免避免檢測(cè)體系中某些物質(zhì)的檢測(cè)體系中某些物質(zhì)的干擾干擾，往往對(duì)樣，往往對(duì)樣品進(jìn)行處理。品進(jìn)行處理。二、分離分析的含義：二、分離分析的含義：1、分離過(guò)程本身可以是、分離過(guò)程本身可以是分析過(guò)程分析過(guò)程樣品干擾嚴(yán)重，需通過(guò)分離再檢查，樣品干擾嚴(yán)重，需通過(guò)分離再檢查，分離過(guò)程和分析過(guò)程耦合，分析性色譜技術(shù)（分離過(guò)程和分析過(guò)程耦合，分析性色譜技術(shù)（HPLC、TLC） 2、分離過(guò)程的分析、分離過(guò)程的分析優(yōu)化純化工藝優(yōu)化純化工藝分離過(guò)程管理：分離過(guò)程管理：定性分析、定量分析、純度、結(jié)構(gòu)和功能分析等定性

3、分析、定量分析、純度、結(jié)構(gòu)和功能分析等3、基本要求：、基本要求：客觀、準(zhǔn)確性，反映分析對(duì)象（目的物質(zhì)）的真實(shí)性?？陀^、準(zhǔn)確性，反映分析對(duì)象（目的物質(zhì)）的真實(shí)性。4、分析方法要求：、分析方法要求：選擇性（特異性）、精確度、靈敏度、重復(fù)性等選擇性（特異性）、精確度、靈敏度、重復(fù)性等第一節(jié)第一節(jié) 概述概述三、如何理解分離純化與分析（三個(gè)層次）三、如何理解分離純化與分析（三個(gè)層次）物質(zhì)的分析離不開(kāi)分離：物質(zhì)的分析離不開(kāi)分離：分析要求樣品的純度：對(duì)樣品進(jìn)行分離純化：如蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu)與分析要求樣品的純度：對(duì)樣品進(jìn)行分離純化：如蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的分析；功能關(guān)系的分析；物質(zhì)分離純化過(guò)程離不開(kāi)分

4、析檢測(cè)：物質(zhì)分離純化過(guò)程離不開(kāi)分析檢測(cè)：分離組分的收集、純度、含量和組分分析；即分離過(guò)程管理。分離組分的收集、純度、含量和組分分析；即分離過(guò)程管理。分離純化過(guò)程即是分析檢測(cè)過(guò)程：分離純化過(guò)程即是分析檢測(cè)過(guò)程：電泳、電泳、HPLC/Ms、GC/Ms、薄層層析、薄層層析(TLC)等；等；l分析是對(duì)事物的感知，是眼睛、是手段分析是對(duì)事物的感知，是眼睛、是手段一、概述一、概述1、一般、一般原理：原理：依據(jù)分離對(duì)象（物質(zhì)）的溶解度、大小在相態(tài)中的分配等特性對(duì)物質(zhì)進(jìn)行依據(jù)分離對(duì)象（物質(zhì)）的溶解度、大小在相態(tài)中的分配等特性對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離純化。分離純化。2、基本程序：基本程序：樣品處理、粗分和精分（例如：蛋白

5、質(zhì)的分離純化）樣品處理、粗分和精分（例如：蛋白質(zhì)的分離純化）3、分類：分類：l初級(jí)分離：初級(jí)分離：沉淀法、膜分離、萃取法、離心法等沉淀法、膜分離、萃取法、離心法等l精制純化：精制純化：吸附層析、凝膠過(guò)濾、離子交換、疏水性相互作用色譜、反向色譜、親和層析吸附層析、凝膠過(guò)濾、離子交換、疏水性相互作用色譜、反向色譜、親和層析第二節(jié)第二節(jié) 分離與純化分離與純化二、初級(jí)分離二、初級(jí)分離（要求：靈活運(yùn)用要求：靈活運(yùn)用）l 目的目的分離對(duì)象（物質(zhì)）初步分離、濃縮、富集的過(guò)程。分離對(duì)象（物質(zhì)）初步分離、濃縮、富集的過(guò)程。l 方法及原理：方法及原理：1、沉淀分級(jí)分離、沉淀分級(jí)分離：鹽析分級(jí)：鹽析分級(jí)：中性鹽（中

6、性鹽（NH4SO4、Na2SO4等等），例如蛋白酶等蛋白質(zhì)類等等），例如蛋白酶等蛋白質(zhì)類等電點(diǎn)分級(jí)：等電點(diǎn)分級(jí)：有機(jī)溶劑：有機(jī)溶劑：熱沉淀：熱沉淀：其它：其它：鹽復(fù)合物、酸堿變性、表面活性劑、鹽復(fù)合物、酸堿變性、表面活性劑、三氯乙酸、三氯乙酸、PEG、重金屬等、重金屬等 聯(lián)合使用：聯(lián)合使用：鹽析鹽析等電點(diǎn)等電點(diǎn)鹽析原理示意圖鹽析原理示意圖2、膜分離：膜分離： 膜分離方法及原理：透析，微濾，納濾，超濾，反滲透，電滲析膜分離方法及原理：透析，微濾，納濾，超濾，反滲透，電滲析 膜材料和特性：膜材料和特性： 有機(jī)膜：有機(jī)膜：（醋酸纖維素、硝基纖維素、聚砜膜、聚砜酰胺膜、聚丙烯腈膜等）（醋酸纖維素、硝基

7、纖維素、聚砜膜、聚砜酰胺膜、聚丙烯腈膜等） 陶瓷膜：陶瓷膜：陶瓷材料陶瓷材料 膜組件：膜組件：管式膜組件，平板式膜組件，螺旋卷式膜組件，中空纖維（毛細(xì)管）等管式膜組件，平板式膜組件，螺旋卷式膜組件，中空纖維（毛細(xì)管）等 應(yīng)用：應(yīng)用：菌體分離，小分子產(chǎn)物分離和回收，蛋白質(zhì)的分離和回收、濃縮和純化等，菌體分離，小分子產(chǎn)物分離和回收，蛋白質(zhì)的分離和回收、濃縮和純化等，膜生物反應(yīng)器。膜生物反應(yīng)器。3、萃?。?、萃?。?、離心：、離心： 分類：分類：低速離心、高速離心、超速離心低速離心、高速離心、超速離心 分離方式：分離方式：差速離心、浮力密度離心（連續(xù)梯度、非連續(xù)梯度）差速離心、浮力密度離心（連續(xù)梯度、

8、非連續(xù)梯度）5、其它：、其它：鹽復(fù)合物、酸堿變性、表面活性劑、三氯乙酸、鹽復(fù)合物、酸堿變性、表面活性劑、三氯乙酸、PEG、重金屬等、重金屬等6、聯(lián)用方法、聯(lián)用方法：膜過(guò)濾膜過(guò)濾-鹽析鹽析等電點(diǎn)，離心等電點(diǎn)，離心萃取，離心萃取，離心-鹽析鹽析等電點(diǎn)等等等電點(diǎn)等等B：精制分離：精制分離色譜分離：色譜分離：（A）精制過(guò)程，純度較高）精制過(guò)程，純度較高（B）方法和原理：流動(dòng)相和固定相的分配系數(shù)不同。分配平衡很快，流動(dòng)相為）方法和原理：流動(dòng)相和固定相的分配系數(shù)不同。分配平衡很快，流動(dòng)相為平推流。平推流。（1）：吸附：吸附解吸附平衡，固定相（吸附劑）解吸附平衡，固定相（吸附劑）流動(dòng)相（洗脫劑）流動(dòng)相（洗脫

9、劑）分配系數(shù)不同和分配平衡。吸附分配系數(shù)不同和分配平衡。吸附解吸附解吸附再吸附的連續(xù)過(guò)程（固相和流動(dòng)再吸附的連續(xù)過(guò)程（固相和流動(dòng)相之間連續(xù)分配的過(guò)程）相之間連續(xù)分配的過(guò)程）l 吸附劑：吸附劑的吸附劑：吸附劑的選擇選擇，表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、，表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低廉。成本低廉。l 吸附劑的選擇：根據(jù)吸附劑的選擇：根據(jù)吸附劑性質(zhì)吸附劑性質(zhì)和被和被分離對(duì)象分離對(duì)象的性質(zhì)選擇。的性質(zhì)選擇。極性強(qiáng)極性強(qiáng)的吸附劑的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)，易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)，非極性強(qiáng)非極性強(qiáng)的吸附劑易吸附非極性強(qiáng)的物質(zhì)。為了的吸附劑易吸附非極性強(qiáng)的物質(zhì)。為了便于便于解吸

10、附解吸附，對(duì)于，對(duì)于極性大極性大的分離對(duì)象，選擇的分離對(duì)象，選擇極性小極性小的吸附劑，反之亦然。吸附劑的吸附劑，反之亦然。吸附劑的選擇的選擇依靠經(jīng)驗(yàn)依靠經(jīng)驗(yàn)和和多次試驗(yàn)多次試驗(yàn)。吸附劑的種類：羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁等吸附劑的種類：羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁等 柱層析：羥基磷灰石，柱層析：羥基磷灰石，Ca3(PO4)3OH2，HA，酸性蛋白質(zhì)、酶、核酸、，酸性蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅膠：含病毒等生命大分子。硅膠：含硅醇基團(tuán)硅醇基團(tuán)（-Si-OH），氨基酸、甾體激素、），氨基酸、甾體激素、皂苷類、類脂和色素等等。皂苷類、類脂和色素等等。 薄層層析：例如，薄層層析：例如，硅膠硅膠薄層層

11、析和薄層層析和聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜薄層層析薄層層析l 硅膠薄層層析：硅膠板，硅膠薄層層析：硅膠板，硅膠硅膠H（純硅膠），能用（純硅膠），能用腐蝕性強(qiáng)的顯色劑腐蝕性強(qiáng)的顯色劑；硅膠硅膠G（10%-15%煅石膏和煅石膏和5%淀粉的硅膠）；淀粉的硅膠）；硅膠硅膠CMC（含羧甲基纖（含羧甲基纖維素）；硅膠維素）；硅膠HF254(含熒光劑的硅膠含熒光劑的硅膠H)，l 硅膠板的制備：玻璃板，硅膠制備（加溶劑碾磨），鋪板，活化，活化硅膠板的制備：玻璃板，硅膠制備（加溶劑碾磨），鋪板，活化，活化測(cè)定（約測(cè)定（約1mg蘇丹黃、蘇丹紅和靛酚藍(lán)混合物乙酸乙酯溶液點(diǎn)樣，苯做蘇丹黃、蘇丹紅和靛酚藍(lán)混合物乙酸乙酯溶液點(diǎn)樣

12、，苯做展層劑，展層劑，Rf大小蘇丹黃大小蘇丹黃蘇丹紅蘇丹紅.靛酚藍(lán)，蘇丹黃靛酚藍(lán)，蘇丹黃Rf）0.5，蘇丹紅和靛酚，蘇丹紅和靛酚藍(lán)藍(lán)Rf之差在之差在0.10.2)。l 分析程序：點(diǎn)樣，展層，顯色。分析程序：點(diǎn)樣，展層，顯色。TLC 色素指紋圖譜和灰度分析色素指紋圖譜和灰度分析 圖圖4 TLC色素指紋圖譜的圖像色素指紋圖譜的圖像灰度灰度分析曲線分析曲線Fig. 4 Intensity curve of pigment fingerprintings on TLC圖圖3色素的色素的TLC指紋圖譜指紋圖譜Fig. 3 Profile of pigments fingerprints on TLCa,

13、 Once Developing Method. b, Repeated Developing Method T1T11T11T1-4T10T9T8T7T6T5a b 重復(fù)展層法：展層劑重復(fù)展層法：展層劑1為石油醚、正己烷、異丙醇、丙酮和甲醇比例為石油醚、正己烷、異丙醇、丙酮和甲醇比例=8-10：0.75-0.95：0.2-0.30：0.8-1.0：0.25-0.35 ；展層劑；展層劑2為石油醚：正己烷：異丙醇：丙酮，比例為為石油醚：正己烷：異丙醇：丙酮，比例為10：0.95：0.22-0.25：0.38-0.41 。重復(fù)展層法呈現(xiàn)的重復(fù)展層法呈現(xiàn)的TLC指紋圖譜能將指紋圖譜能將CQV97菌株

14、全色素分辨成菌株全色素分辨成11條不同顏色條帶的色條不同顏色條帶的色素組分，從下而上依次為黃綠色、藍(lán)綠、深藍(lán)綠、綠色、紫色、黃色、黃色、紫色、素組分，從下而上依次為黃綠色、藍(lán)綠、深藍(lán)綠、綠色、紫色、黃色、黃色、紫色、紅色、紅棕色和橙黃色紅色、紅棕色和橙黃色 l 聚酰胺薄膜薄層層析：聚酰胺薄膜薄層層析：DNS氨基酸分析，氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），（二甲氨基萘磺酰氯），靈敏度靈敏度10-910-10mol/L。DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定條件下和氨基酸或多肽在特定條件下反應(yīng)。反應(yīng)。DABTH-氨基酸的薄層層析分析蛋白質(zhì)序列。氨基酸的薄層層析分析蛋白質(zhì)序列。Edman降解試劑

15、降解試劑DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯二甲氨基偶氮苯-4-異硫氰異硫氰酸酯）進(jìn)行微量蛋白質(zhì)序列分析（酸酯）進(jìn)行微量蛋白質(zhì)序列分析（210 nmol肽樣品）。肽樣品）。單向紙層析單向紙層析 雙向紙層析雙向紙層析 薄層層析薄層層析（2）凝膠過(guò)濾：排阻色譜或分子篩層析，根據(jù)分子顆粒大小進(jìn)行分離）凝膠過(guò)濾：排阻色譜或分子篩層析，根據(jù)分子顆粒大小進(jìn)行分離 原理：分子在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透，由于分子在篩孔中的原理：分子在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透，由于分子在篩孔中的分配系數(shù)分配系數(shù)不同不同，將分子分離。排阻的范圍為，將分子分離。排阻的范圍為0100%。 分配系數(shù)：分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系

16、。分配系數(shù)：分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系。Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo) Vt=Vo+Vi+Vg，Vt、Vo、Vi和和Vg分別為床體積、外水體積、內(nèi)水體分別為床體積、外水體積、內(nèi)水體積和介質(zhì)的體積。積和介質(zhì)的體積。 分離物質(zhì)的大小，分離物質(zhì)的大小，0 Kav 1， Kav=0或或Kav=1，不能分離不能分離。常用介質(zhì)：常用介質(zhì)：交聯(lián)交聯(lián)葡聚糖葡聚糖（Sephadex G10G200）；）； Amersham Biosciences交聯(lián)交聯(lián)瓊脂糖瓊脂糖（Sepharose CL-4B,CL-6B）Sephacryl S 系列（聚丙烯酰胺系列（聚丙烯酰胺-葡聚糖）葡聚糖）Supe

17、rdex 系列系列 （高交聯(lián)瓊脂糖（高交聯(lián)瓊脂糖-葡聚糖）葡聚糖）Bio-Beads S-X系列系列 （苯乙烯（苯乙烯-二乙烯苯）二乙烯苯）Bio-Gel P系列系列 （聚丙烯酰胺）（聚丙烯酰胺） Bio-RadBio-Gel A系列系列 （瓊脂糖）（瓊脂糖）TSKgel SW 系列系列 （硅膠）（硅膠）TSKgel Toyopearl HW 系列，親水性聚乙烯醇系列，親水性聚乙烯醇 Toyo Soda TSKgel PW 系列系列 親水性聚乙烯親水性聚乙烯TSKgel CW-35 纖維素纖維素Cellulofine 纖維素纖維素 Chisso操作程序：操作程序： 凝膠選擇和處理（型號(hào)和粒度、

18、凝膠用量、凝膠處理）凝膠選擇和處理（型號(hào)和粒度、凝膠用量、凝膠處理） 凝膠柱的制備（柱選擇，徑長(zhǎng)比約為凝膠柱的制備（柱選擇，徑長(zhǎng)比約為1:251:100，裝柱、柱鑒定），裝柱、柱鑒定）， 加樣和洗脫（加樣、洗脫、樣品收集，檢測(cè)）加樣和洗脫（加樣、洗脫、樣品收集，檢測(cè)） 凝膠柱的再生和保存凝膠柱的再生和保存應(yīng)用：應(yīng)用： 分離純化，脫鹽和濃縮，去熱源物質(zhì)、分析檢測(cè)分離純化，脫鹽和濃縮，去熱源物質(zhì)、分析檢測(cè) （定性、定量、分子量）。（定性、定量、分子量）。（3）離子交換：）離子交換：電荷大小電荷大小陽(yáng)離子交換劑：，羧甲基（陽(yáng)離子交換劑：，羧甲基（-O-CH2-COO-）陰離子交換劑：氨基乙級(jí)（陰離子

19、交換劑：氨基乙級(jí)（-O(CH2)2-NH3+）常用介質(zhì)常用介質(zhì)DEAE（二乙胺基以及）（二乙胺基以及）Cellulose DE-23 DEAECellulose DE-52DEAE- Sephadex A-50（25）DEAE-Sepharos CL-6bDEAE-Bio-Gel A CM- Cellulose DE-52CM- Cellulose DE-32CM- Sephadex C-25(50)洗脫方式，梯度洗脫，線性和非線性洗脫洗脫方式，梯度洗脫，線性和非線性洗脫應(yīng)用：物質(zhì)分離、測(cè)定等電點(diǎn)（應(yīng)用：物質(zhì)分離、測(cè)定等電點(diǎn)（PI）0100200300400500600700800900100

20、0110012003004005006007008009001000020406080100Absorbance(mAU)Retention (ml) A280 A380 A480 CNaCl(10-2mol/L) CondPeak1 Peak2Peak 3 4Peak 5 6 7Peak8Peak9分離純化洗脫曲線和紫外吸收光譜分離純化洗脫曲線和紫外吸收光譜圖3. A菌80%鹽析浮質(zhì)DEAE-52層析洗脫曲線圖4. A菌不同鹽濃度洗脫組分吸收光譜（a、b、c）。 注：a、b、c中7個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)不同NaCl濃度，：峰3、4為0.050.10M洗脫組分，峰5、6、7為0.10.15M洗脫組分，峰

21、8為0.150.2M洗脫組分，峰9為0.200.30M洗脫峰。峰8稀釋6倍。3004005006007008009000.00.20.40.6AbsorbanceWavelength/nm Peak 5 Peak 6 Peak 7 b3004005006007008009000.00.20.40.60.81.01.21.4AbsorbanceWavelength/nm Peak 8 Peak 9 c3004005006007008009000.00.10.20.30.4AbsorbanceWavelength/nm Peak 3 Peak 4 a020406080020406080100120

22、0246810Absorbance（mAU）Retention (ml) A280 A380 A480 Cond（mS/cm） Condabcdeb Retention time 47.78min Retention volume 38.167mL Flow 0.8mL/min02040608010012002060801001201401600246810Absorbance（mAU）Retention (ml) A280 A380 A480abc Cond（mS/cm） conda Retention time 73.86min Retention volume 36.916mL Flow

23、 0.5mL/min 02040608010012002040601001502002503003500246810Absorbance(mAU)Retention (ml) A280 A380 A480aba Retention time 74.30min Retention volume 37.146mL Flow 0.5mL/min cond Cond（mS/cm） 圖7、8、9. 分別為A菌Peak34、Peak7和Peak8組份分子篩層析結(jié)果。圖7圖8圖9注：圖均為280nm、380nm和480nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的洗脫曲線，此外圖中綠線代表鹽濃度；圖7中b為主要目標(biāo)蛋白，圖8中a為主要目

24、標(biāo)蛋白，圖9中a為主要目標(biāo)蛋白；圖中標(biāo)注各主要目標(biāo)蛋白洗脫時(shí)間和洗脫體積，以及洗脫流速。A菌菌（4）疏水性相互作用色譜，利用）疏水性相互作用色譜，利用疏水作用疏水作用不同將蛋白質(zhì)等不同將蛋白質(zhì)等大分子分離，大分子分離， 利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)（疏水性配基）的利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)（疏水性配基）的疏水吸附劑疏水吸附劑為為固定固定相相，蛋白質(zhì)等大分子與，蛋白質(zhì)等大分子與疏水吸附劑疏水吸附劑之間弱疏水作用的差異進(jìn)行物之間弱疏水作用的差異進(jìn)行物質(zhì)的分離。質(zhì)的分離。 疏水吸附材料疏水吸附材料，含有苯基、辛基、丁基、醚基的吸附材料，含有苯基、辛基、丁基、醚基的吸附材料 高鹽溶液中吸附能力強(qiáng)，降低鹽度將

25、物質(zhì)洗脫分離。高鹽溶液中吸附能力強(qiáng)，降低鹽度將物質(zhì)洗脫分離。 成本高，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模分離成本高，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模分離（5）反向色譜：）反向色譜： 利用表面利用表面非極性非極性的的介質(zhì)介質(zhì)為為固定相固定相，極性極性有機(jī)溶劑的水溶液為有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相流動(dòng)相，或極性有機(jī)溶劑（甲醇、乙腈等），進(jìn)行物質(zhì)分離的方法。特點(diǎn)是固或極性有機(jī)溶劑（甲醇、乙腈等），進(jìn)行物質(zhì)分離的方法。特點(diǎn)是固定相表面完全被非極性基團(tuán)覆蓋，具有強(qiáng)的疏水性。定相表面完全被非極性基團(tuán)覆蓋，具有強(qiáng)的疏水性。 介質(zhì)：以硅膠為載體，經(jīng)硅烷化連接介質(zhì)：以硅膠為載體，經(jīng)硅烷化連接C4、C8、C18烷基或苯基，常烷基或苯基，常用用C18硅烷化硅烷化

26、類別：類別：制備型色譜制備型色譜和和分析型色譜分析型色譜，應(yīng)用：物質(zhì)的分離和檢測(cè)（定性和，應(yīng)用：物質(zhì)的分離和檢測(cè)（定性和定量分析）定量分析）10203040500100200H10H11H9H8H7H6H5H4H3H2 Absorbance / mAURetention time / minH1反向反向C18層析柱層析柱液相色譜儀層析示意圖樣品：沼澤紅假單胞菌（6）親和層析）親和層析 固定相：特異性吸附材料，如酶抑制劑、抗原固定相：特異性吸附材料，如酶抑制劑、抗原抗體、抗體、A蛋白、蛋白、配體配體配基、過(guò)渡金屬離子（配基、過(guò)渡金屬離子（Cu、Ni、Zn、Co等離子）與等離子）與O、S、N等等供

27、電子基團(tuán)供電子基團(tuán)形成形成配位鍵配位鍵。與蛋白質(zhì)表面。與蛋白質(zhì)表面組氨酸的咪唑基組氨酸的咪唑基、半半胱氨酸的巰基胱氨酸的巰基、色氨酸的、色氨酸的吲哚基吲哚基發(fā)生親和作用。如發(fā)生親和作用。如Ni柱柱分離帶有分離帶有組氨酸標(biāo)簽的工程蛋白。組氨酸標(biāo)簽的工程蛋白。 程序：選擇凝膠、專一性合成、分析鑒定、裝柱上樣、吸附、清程序：選擇凝膠、專一性合成、分析鑒定、裝柱上樣、吸附、清洗、解析，柱再生洗、解析，柱再生 解析劑：低解析劑：低pH 、高鹽、競(jìng)爭(zhēng)性洗脫劑、高鹽、競(jìng)爭(zhēng)性洗脫劑、鹽酸胍鹽酸胍 尿素尿素等變性劑，等變性劑， 再生：再生：高濃度鹽高濃度鹽 應(yīng)用：物質(zhì)分離、測(cè)定活性應(yīng)用：物質(zhì)分離、測(cè)定活性四、分

28、離純度的鑒定方法四、分離純度的鑒定方法電泳、色譜（薄層色譜、凝膠色譜）、電泳、色譜（薄層色譜、凝膠色譜）、質(zhì)譜、結(jié)晶、質(zhì)譜、結(jié)晶、N-分析、熔點(diǎn)等分析、熔點(diǎn)等五、分離過(guò)程的控制及檢測(cè)五、分離過(guò)程的控制及檢測(cè)1、純化方案的設(shè)計(jì)、純化方案的設(shè)計(jì)（1）目的：從原材料中提取純化）目的：從原材料中提取純化目的成分目的成分（分離對(duì)象），設(shè)計(jì)方案，指導(dǎo)分離（分離對(duì)象），設(shè)計(jì)方案，指導(dǎo)分離過(guò)程。過(guò)程。（2）依據(jù)：）依據(jù)：分離對(duì)象分離對(duì)象的性質(zhì)和特點(diǎn)（溶解度、電荷、分子大小、與配體親和力的性質(zhì)和特點(diǎn)（溶解度、電荷、分子大小、與配體親和力等），結(jié)合等），結(jié)合分離純化方法分離純化方法的特點(diǎn)，對(duì)分離方法進(jìn)行比較分析，

29、選擇出的特點(diǎn)，對(duì)分離方法進(jìn)行比較分析，選擇出一種或一種或幾種方法的組合幾種方法的組合。（3）原則：）原則： 各種分離方法各有特色，操作程序簡(jiǎn)繁不一；各種分離方法各有特色，操作程序簡(jiǎn)繁不一； 考慮分離對(duì)象的特性和結(jié)構(gòu)以及取材的特點(diǎn)，考慮分離對(duì)象的特性和結(jié)構(gòu)以及取材的特點(diǎn)， 深入了解各種分離方法的原理和用途，合理、巧妙地設(shè)計(jì)純化方案，深入了解各種分離方法的原理和用途，合理、巧妙地設(shè)計(jì)純化方案， 純化方案中，忌諱一種分離方法重復(fù)使用，純化效率不高，反而降低回收率。純化方案中，忌諱一種分離方法重復(fù)使用，純化效率不高，反而降低回收率。 分離方案不是僵化的，在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)方案及所選方法進(jìn)行不斷修正、調(diào)節(jié)、完善。分離方案不是僵化的，在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)方案及所選方法進(jìn)行不斷修正、調(diào)節(jié)、完善。（4）分離方法的測(cè)試）分離方法的測(cè)試分離過(guò)程檢測(cè)分離過(guò)程檢測(cè) 定向分離、靶向分離定向分離、靶向分離都離不開(kāi)分離對(duì)象的都離不開(kāi)分離對(duì)象的檢測(cè)與分析檢測(cè)與分析2、純化方法的評(píng)價(jià)、純化方法的評(píng)價(jià)理論分析的局限性：理論分析的局限性：只有通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)；獲得提取工藝只有通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)；獲得提取工藝評(píng)價(jià)方法：評(píng)價(jià)方法：對(duì)分離過(guò)程的每一步收集對(duì)分離過(guò)程的每一步收集留份（洗脫留份）留份（洗脫留份）進(jìn)行分析檢測(cè)；進(jìn)行分析檢測(cè)；測(cè)定指標(biāo)：測(cè)定指標(biāo)：測(cè)定測(cè)定2個(gè)：測(cè)定含量和活性