分子生物學(xué)：第八章 基因工程與體外表達(dá)

1、1第八章第八章 基因工程與體外表達(dá)基因工程與體外表達(dá) Gene Engineering and Gene Expression 2目的要求目的要求 掌握：限制性核酸內(nèi)切酶的概念與特點(diǎn)；掌握：限制性核酸內(nèi)切酶的概念與特點(diǎn)；質(zhì)粒載體的特點(diǎn)；基因克隆的基本過(guò)程。質(zhì)粒載體的特點(diǎn)；基因克隆的基本過(guò)程。 了解：其他常用工具酶的特點(diǎn)。了解：其他常用工具酶的特點(diǎn)。 【重點(diǎn)重點(diǎn)】基因克隆的基本過(guò)程?；蚩寺〉幕具^(guò)程。345 基因工程是指在體外對(duì)基因工程是指在體外對(duì)DNA分子按分子按照既定的目的和方案，對(duì)照既定的目的和方案，對(duì)DNA進(jìn)行剪切和進(jìn)行剪切和重新連接，然后把它導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而重新連接，然后把它導(dǎo)入宿

2、主細(xì)胞，從而能夠擴(kuò)增有關(guān)能夠擴(kuò)增有關(guān)DNA片段，表達(dá)有關(guān)基因產(chǎn)片段，表達(dá)有關(guān)基因產(chǎn)物，進(jìn)行物，進(jìn)行DNA序列分析，基因治療，研究序列分析，基因治療，研究基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等），以及研究基因的功能等。等），以及研究基因的功能等。 6 第一節(jié)第一節(jié) 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶一、限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease） 從雙鏈從雙鏈DNA內(nèi)部特異位點(diǎn)識(shí)別并且裂內(nèi)部特異位點(diǎn)識(shí)別并且裂解磷酸二酯鍵。解磷酸二酯鍵。7 限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)類型類型 限制性限制性 修飾作用修飾

3、作用 識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn) 切割位點(diǎn)切割位點(diǎn) 型型 有有 有有 特異特異 識(shí)別位點(diǎn)下游識(shí)別位點(diǎn)下游100100到到1000bp1000bp型型 有有 無(wú)無(wú) 特異特異 可知、固定可知、固定型型 有有 有有 特異特異 識(shí)別位點(diǎn)附近切割識(shí)別位點(diǎn)附近切割DNADNA， 切割位點(diǎn)很難預(yù)測(cè)。切割位點(diǎn)很難預(yù)測(cè)。82 2限制性內(nèi)切酶的命名限制性內(nèi)切酶的命名 EcoREcoR E E代表代表EscherichiaEscherichia屬屬 coco代表代表coli coli 種種 R R代表代表RY13RY13株株95 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 5 G 3 CTTAA AATTC3 G5 5 53 3

4、限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割位點(diǎn) 通常是通常是4 46 6個(gè)堿基對(duì)、具有回文序列個(gè)堿基對(duì)、具有回文序列（palindrompalindrom）的）的DNADNA片段，大多數(shù)酶是錯(cuò)片段，大多數(shù)酶是錯(cuò)位切割雙鏈位切割雙鏈DNADNA，產(chǎn)生，產(chǎn)生5 5或或3 3黏性末端黏性末端（sticky endsticky end）。）。 如如EcoREcoR切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生5 5黏性末端：黏性末端：10PstPst切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生3 3黏性末端：黏性末端： 有一些酶沿對(duì)稱軸切斷有一些酶沿對(duì)稱軸切斷DNA，產(chǎn)生平端，產(chǎn)生平端或鈍端（或鈍端（Blunt end）, 如如Sma：5

5、-CTGCAG-3 5 -CTGCA G-3 3 -GACGTC-5 3 -G ACGTC-5 5 -CCCGGG-3 5 -CCC GGG-3 3 -GGGCCC-5 3 -GGG CCC-5 11二、二、 T4 DNA連接酶（連接酶（T4 DNA ligase） 催化雙鏈催化雙鏈DNA一端一端3-OH與另一雙鏈與另一雙鏈DNA的的5端磷端磷酸根形成酸根形成35磷酸二酯鍵，使具有相同黏性末端或磷酸二酯鍵，使具有相同黏性末端或平端的平端的DNA兩端連接起來(lái)。兩端連接起來(lái)。 12 第二節(jié)第二節(jié) 基因克隆的載體基因克隆的載體 載體是攜帶目的基因，使其在宿主細(xì)載體是攜帶目的基因，使其在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制

6、或表達(dá)的胞內(nèi)復(fù)制或表達(dá)的DNA分子。分子。13一、常用的克隆載體一、常用的克隆載體 (一一)質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid） 是存在于多數(shù)細(xì)菌和某些真核生物染是存在于多數(shù)細(xì)菌和某些真核生物染色體外的雙鏈環(huán)狀的色體外的雙鏈環(huán)狀的DNA分子。分子。 14作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備下列特點(diǎn)：作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備下列特點(diǎn)：（1）分子量相對(duì)較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存）分子量相對(duì)較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存 在，有較高的拷貝數(shù)。在，有較高的拷貝數(shù)。（2）具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于對(duì)宿主）具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于對(duì)宿主 細(xì)胞進(jìn)行選擇，如抗生素抗性基因，細(xì)胞進(jìn)行選擇，如抗生素抗性基因， -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶

7、基因（Lac Z）等。）等。（3）具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，便）具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，便 于外源基因的插入。于外源基因的插入。 1516( (二二)噬菌體噬菌體 野生型野生型噬菌體經(jīng)過(guò)改造，已衍生出噬菌體經(jīng)過(guò)改造，已衍生出100多種多種克隆載體。克隆載體。 噬菌體載體分為插入型和替換型噬菌體載體分為插入型和替換型(置換置換型型)兩類。兩類。 目前應(yīng)用較廣的是目前應(yīng)用較廣的是EMBL系列、系列、gt系列和系列和Charon系列等。系列等。 17 gt10和和gt11載體適用于建立載體適用于建立cDNA文庫(kù)。這文庫(kù)。這兩個(gè)載體都屬插入型載體，能克隆兩個(gè)載體都屬插入型載體，能克隆7k

8、b以下的外以下的外源源DNA。 gt11為表達(dá)型載體為表達(dá)型載體。18( (三三) M13) M13噬菌體噬菌體 (M13 phage) 一種大腸桿菌雄性特異絲狀噬菌體。一種大腸桿菌雄性特異絲狀噬菌體。 感染細(xì)菌感染細(xì)菌后，經(jīng)過(guò)復(fù)制轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈的復(fù)制型（后，經(jīng)過(guò)復(fù)制轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈的復(fù)制型（RF）。復(fù)制型）。復(fù)制型M13可用作克隆載體。可用作克隆載體。1920( (四四) )黏性質(zhì)粒（黏性質(zhì)粒（cosmidcosmid） 是由是由噬菌體的黏性末端（噬菌體的黏性末端（cos區(qū)）與質(zhì)區(qū)）與質(zhì)粒重新構(gòu)建的載體，為雙鏈、環(huán)狀粒重新構(gòu)建的載體，為雙鏈、環(huán)狀DNA。其。其克隆容量可達(dá)克隆容量可達(dá)4050 kb。

9、21( (五五) ) 病毒載體病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、EB病毒等作為基因轉(zhuǎn)移的載體。多數(shù)病毒病毒等作為基因轉(zhuǎn)移的載體。多數(shù)病毒載體均已質(zhì)?；《据d體質(zhì)粒主要由病載體均已質(zhì)?；?，病毒載體質(zhì)粒主要由病毒啟動(dòng)子、包裝元件、選擇性遺傳標(biāo)記，毒啟動(dòng)子、包裝元件、選擇性遺傳標(biāo)記，以及以及pBR322的復(fù)制子組成。的復(fù)制子組成。22二二、表達(dá)載體表達(dá)載體 (一一) 原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體 表達(dá)載體中含有復(fù)制起始位點(diǎn)、抗性基表達(dá)載體中含有復(fù)制起始位點(diǎn)、抗性基因因 、克隆位點(diǎn)、克隆位點(diǎn) 、啟動(dòng)子、啟動(dòng)子 、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。和轉(zhuǎn)錄

10、終止信號(hào)。23 multiple cloning site24(二二) 真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體 含有原核復(fù)制起始位點(diǎn)、抗生素抗性含有原核復(fù)制起始位點(diǎn)、抗生素抗性基因基因. 還含有真核表達(dá)元件還含有真核表達(dá)元件,包括啟動(dòng)子、包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、克隆位點(diǎn)、增強(qiáng)子、克隆位點(diǎn)、 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和poly (A) 加尾信號(hào)加尾信號(hào).25 第三節(jié)第三節(jié) 基因克隆的基本過(guò)程基因克隆的基本過(guò)程 基因克隆主要步驟：基因克隆主要步驟：制備目的基因和選擇相關(guān)載體制備目的基因和選擇相關(guān)載體目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接重組的重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞DNA重組體的篩選和鑒

11、定重組體的篩選和鑒定DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究26 （二）從（二）從cDNA文庫(kù)中獲得文庫(kù)中獲得 （三）（三）PCR擴(kuò)增特定基因擴(kuò)增特定基因 （四）人工合成（四）人工合成一、一、 目的基因的獲得目的基因的獲得 （一）從基因組文庫(kù)中獲得（一）從基因組文庫(kù)中獲得27幾種常用克隆載體的比較幾種常用克隆載體的比較注：注：+ +表示可用；表示可用；- -表示不可用表示不可用比較內(nèi)容比較內(nèi)容 質(zhì)質(zhì) 粒粒 噬菌體噬菌體 黏性質(zhì)粒黏性質(zhì)粒 M13噬菌體噬菌體克隆容量克隆容量 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù) - + + -cDNA文

12、庫(kù)文庫(kù) + + - -亞克隆亞克隆 + - - +序列分析序列分析 + + - +E.coli表達(dá)表達(dá) + + - -二、載體的選擇與準(zhǔn)備二、載體的選擇與準(zhǔn)備28三、三、DNADNA分子的體外連接分子的體外連接（一）黏性末端（一）黏性末端（二）人工接頭的使用（二）人工接頭的使用（三）加入同聚體尾（三）加入同聚體尾（四）平端連接（四）平端連接29（一）黏性末端（一）黏性末端30（二）人工接頭（二）人工接頭31（三）加入同聚體尾（三）加入同聚體尾待克隆待克隆DNADNA片段片段重組質(zhì)粒重組質(zhì)?；旌?、退火混合、退火空白質(zhì)粒空白質(zhì)粒32（四）平端連接（四）平端連接33四、外源四、外源DNADNA導(dǎo)入宿

13、主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞 （一）轉(zhuǎn)化（一）轉(zhuǎn)化（transformation） （二）感染（二）感染（infection） （三）轉(zhuǎn)染（三）轉(zhuǎn)染（transfection） 34五、目的基因的篩選和鑒定五、目的基因的篩選和鑒定 外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后，篩選含有外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后，篩選含有目的基因的陽(yáng)性克隆并加以擴(kuò)增。目的基因的陽(yáng)性克隆并加以擴(kuò)增。 所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、學(xué)方法、核酸雜交法、PCR等。等。35（一）（一） 遺傳學(xué)方法遺傳學(xué)方法 插入滅活法插入滅活法1.362. 藍(lán)藍(lán)-白篩選（白篩選（互補(bǔ)）互補(bǔ)） 許多載體（如許多載體（如

14、M13M13系列、系列、pUCpUC系列、系列、pGEMpGEM系列）都系列）都含有含有-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（laclacZ Z）的調(diào)控序列和氨基）的調(diào)控序列和氨基端端145145個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)。這種載體適用于可編碼個(gè)多克隆位點(diǎn)。這種載體適用于可編碼-半乳糖苷半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。宿主和載體編碼的片酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。宿主和載體編碼的片段各自均無(wú)酶活性，但它們可以互補(bǔ)形成具有活性的段各自均無(wú)酶活性，但它們可以互補(bǔ)形成具有活性的-半乳糖苷酶，使人工底物半乳糖苷酶，使人工底物X-X-ga

15、lgal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色的代謝轉(zhuǎn)化成藍(lán)色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外產(chǎn)物，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源源DNADNA片段，將使片段，將使lac Zlac Z基因滅活，不能生成有活性的基因滅活，不能生成有活性的-半乳糖苷酶，結(jié)果菌落呈現(xiàn)白色。半乳糖苷酶，結(jié)果菌落呈現(xiàn)白色。373839（二）（二） 免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法 如果克隆基因的產(chǎn)物是已知的，并且如果克隆基因的產(chǎn)物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表達(dá)，因而可用相應(yīng)的在菌落或噬菌斑中表達(dá)，因而可用相應(yīng)的抗血清或單克隆抗體，通過(guò)放射免疫、化抗血清或單克隆抗體，通過(guò)放射免疫、化學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)進(jìn)行篩選。學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)

16、進(jìn)行篩選。 40（三）（三） 核酸雜交法核酸雜交法 對(duì)菌斑或菌落進(jìn)行原位分子雜交是從對(duì)菌斑或菌落進(jìn)行原位分子雜交是從基因組文庫(kù)、基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)或重組質(zhì)粒中篩文庫(kù)或重組質(zhì)粒中篩選目的基因的最有效的方法之一，而且這選目的基因的最有效的方法之一，而且這種篩選不取決于目的基因是否表達(dá)。種篩選不取決于目的基因是否表達(dá)。41菌落原位雜交菌落原位雜交的原理的原理 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 E. coli并鋪于瓊脂平板上并鋪于瓊脂平板上將膜放置將膜放置平板表面平板表面定位、揭起定位、揭起變性、變性、中和、中和、固定固定雜交、雜交、洗膜、洗膜、顯影顯影42（四）（四） PCRPCR技術(shù)技術(shù) 具有高度的靈敏度和特異性，

17、能在極具有高度的靈敏度和特異性，能在極短的時(shí)間內(nèi)將目的基因擴(kuò)增至數(shù)百萬(wàn)倍，短的時(shí)間內(nèi)將目的基因擴(kuò)增至數(shù)百萬(wàn)倍，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，可直接觀察到產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，可直接觀察到產(chǎn)物的存在。的存在。 43( (五五) ) 酶切鑒定酶切鑒定 用抗生素篩選、藍(lán)白篩選等方法篩選出用抗生素篩選、藍(lán)白篩選等方法篩選出的菌落需進(jìn)一步進(jìn)行酶切分析，鑒定插入的菌落需進(jìn)一步進(jìn)行酶切分析，鑒定插入片段的大小和插入方向。片段的大小和插入方向。 44舉例：舉例： 人腫瘤壞死因子在大腸桿菌中的表達(dá)人腫瘤壞死因子在大腸桿菌中的表達(dá)45464748495051人腫瘤壞死因子基因序列ATGAGCACTGAAAGCATGATC

18、CGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGGGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGTTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCC