GCMS法中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸測定與計(jì)算的探討

1、GCMS法中飽和脂肪酸與不飽和 脂肪酸測定與計(jì)算的探討GCMS 法中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸測定與 計(jì)算的探討我從事食品檢測行業(yè)已經(jīng) 6 年了，真正接觸 脂肪酸測還是在 08 年初。所以在這方面我并不 是做得很好， 但是由于這個(gè)方法， 我從研發(fā)到初 步的成型整整用了一年的時(shí)間。 在這一年的研發(fā) 過程中，我走了很多的歪路， 但也從中學(xué)到很多， 現(xiàn)在我把我的經(jīng)驗(yàn)寫出來讓大家分享一下， 同時(shí) 也希望各位能給我指出我的不足之處，謝謝！ 當(dāng)時(shí)公司提出要開發(fā)食品營養(yǎng)標(biāo)簽的測試， 這個(gè)營養(yǎng)標(biāo)簽中就有二個(gè)是用到氣相色譜法測 定的，脂肪酸就其中的一個(gè)。雖然在大學(xué)里就有聽說過飽和脂肪酸、 不飽 和脂肪酸、 反式脂

2、肪酸、 單不飽和脂肪酸和多不 飽和脂肪酸這個(gè)東西，但是我還真沒做過。開始拿到方法當(dāng)時(shí)還是 GB/T17376-1998 和 17377-1998 我當(dāng)時(shí)拿著這兩個(gè)方法是看了又 看看了又看就是看不明白他是怎么計(jì)算的。 當(dāng)我 搞明白計(jì)算方法后， 又來了一個(gè)難題了， 那就是 為什么這個(gè)計(jì)算又分面積歸一化法和內(nèi)標(biāo)法呢？由于我主要說的是關(guān)于脂肪酸的測定， 那么 對(duì)于以上問題我是怎么去做的， 在后面可能會(huì)講 到，如果沒有講到的大家也可以給我留言大家相 互交流。以下我來說說關(guān)于 GCMS 測定脂肪酸的方 法。我們所有標(biāo)品是已經(jīng)甲脂化好的標(biāo)液。 34 種混合標(biāo)液。這 37 種混合標(biāo)準(zhǔn)品要一針全部走出來且要 全

3、部分開那可不是一件容易的事， 所以當(dāng)時(shí)在做 這個(gè)方法時(shí)，當(dāng)時(shí)標(biāo)液都用去了一半。由于之前在想 60m 的柱子（ ZB-624 ）應(yīng)該 就可以把這 34 種物質(zhì)全部份開，但是沒想怎么 不管我用多度的流速多小的升溫程序都是無法 把 C18 里的幾個(gè)正反式分開，分得最好時(shí)也是 有幾個(gè)三個(gè)峰連在一齊， 是后實(shí)在不行， 只能重 新購買 CP-Sil 88 VARIAN 100m 的柱子。100m 的柱子購買回來后就是一個(gè)不段的調(diào) 試，以更能最好的把 34 種脂肪酸全部分開，這 程就不多說了， 現(xiàn)在就說說我們最終方法。 進(jìn)樣 口溫度 220度，柱溫箱初溫 150 度保持 15 分鐘 后以 3 度每分鐘的到

4、220度保持 3 分鐘。柱流速 我采用的是恒流模試 1ml/min 。MS 從第 8 分鐘后才打開。也許在些會(huì)有很多人在想我為什么要以這個(gè) 程序，我在些說明一下， 每個(gè)方法的建立跟操作 者是一定的關(guān)系， 由于本人的一貫的做法都是以 節(jié)儉時(shí)間為主， 因脂肪酸在 150 度才會(huì)出峰， 所 以我會(huì)把最低溫度設(shè)成 150 度，而脂肪酸基本上 在 220 度就完全出完了， 所以最我的溫度也只設(shè) 到 220 度。哈哈，人懶就是那樣的，還有一定會(huì) 有人在想為什么要用 3 度每分鐘做為升溫速率 而不用 2度或 4度每分鐘呢？先說一下用 4度每 分鐘時(shí) C18：2 中順反異構(gòu)體基本上有一半重合 在一齊了。如果用

5、 2 度每分鐘時(shí) C18 里的好幾 個(gè)峰基本上也是重合在一齊了， 因?yàn)樯郎厮俾矢?了各組分的出峰時(shí)間都快了， 所以會(huì)導(dǎo)致沸點(diǎn)相 近的物質(zhì)就會(huì)一齊出來了， 而升溫速率低的會(huì)由 于溶易出現(xiàn)拖尾從而導(dǎo)致峰從疊。 有點(diǎn)一須要注 意的是我們做樣品時(shí)跟我們進(jìn)標(biāo)液并不一樣， 標(biāo) 液濃度的比例基本一致， 所以我們選擇進(jìn)樣時(shí)就 不會(huì)因?yàn)槟骋粯悠窛舛却蠖哑渌臐舛刃〉?物質(zhì)峰所掩蓋了，而樣品卻并不是 34 種脂肪酸 都會(huì)出現(xiàn)，也有可能會(huì)出現(xiàn) 34 種以外的物質(zhì)的 峰，有些物質(zhì)的其 C18：1 油酸的峰非常大經(jīng)常 在色譜圖上看其保留時(shí)間與 C18：1 反油酸的時(shí) 間最接近，而自然界中反式脂肪酸是不可能存在 的，但

6、由于些峰的保留時(shí)間與 C18：1 反油酸是 最接近的你怎么去判斷其是油酸還是反油酸 呢？在此之前我用過質(zhì)譜圖來判斷但是由于油 酸與反油酸均是 C18：1 那他的質(zhì)譜圖可以說是 完全一樣的，那么這樣用色譜和質(zhì)譜均無法判斷 其是順的還是反的呢？最后想到了把樣品稀釋 到與標(biāo)準(zhǔn)溶液相接進(jìn)的濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)的保 留時(shí)間往回靠了一點(diǎn)， 正好與油酸的保留時(shí)間相 重疊，這樣就可以判斷其是順式還是反式， 到這 里就會(huì)有很多人說竟然這樣就可以判斷了為什 么還要用質(zhì)譜做， 而不用色譜做呢？大家想過沒 有脂肪酸總共有多少種呢？無計(jì)其數(shù)， 如果我們 用色譜圖做的話那么就有可能把一些不是脂肪 酸的物質(zhì)當(dāng)做脂肪酸計(jì)算進(jìn)去了

7、， 而是脂肪酸的 卻沒有計(jì)算進(jìn)去， 那么我們的測試就會(huì)有很大的 結(jié)果差異，雖然說質(zhì)譜是一個(gè)半定量的一種檢測 器，但我個(gè)人覺得只要不出現(xiàn)很大的干擾質(zhì)譜的定量還是非常的準(zhǔn)確的。以下的色譜圖大家可以看看這個(gè)是我所用的 條件分出來的34種物質(zhì)的峰，分得還可以吧， 我所用的 GCMS 是 Agilent 6890N-5975, CP-Sil 88 VARIAN 100m的柱子，但是大家使用時(shí)也不 一定要按我這個(gè)條件選擇啊，這個(gè)圖只是跟我的 儀器還用我使用的色譜柱有關(guān)，如果色譜柱已經(jīng) 用了很久的話可能用這條件走出來的峰就會(huì)很 差的哦。各組份為丁酸甲酯(C4:0) Methyl Butyrate 623-4

8、2-7己酸甲酯(C6:0) Methyl Caproate 106-70-7辛酸甲酯(C8:0) Methyl Caprylate 111-11-5癸酸甲酯(C10:0) Methyl Pelargonate 110-42-9十一烷酸甲酯(C11:0) Methyl Hendecanoate 1731-86-8十二烷酸甲酯(C12:0)/ 月桂酸甲酯 Methyl Laurate 111-82-0十三烷酸甲酯(C13:0) Methyl Tridecanoate 1731-88-0十四烷酸甲酯(C14:0)/豆蔻酸甲酯 Methyl Myristate 124-10-7十五烷酸甲酯(C15:0

9、) Methyl Pentadecanoate 7132-64-1十六烷酸甲酯(C16:0)/棕櫚酸甲酯 Methyl Palmitate 112-39-0 十七烷酸甲酯(C15:0) Methyl Margarate十八烷酸甲酯（C18:0）/硬脂酸甲酯 Methyl Stearate 112-61-8二十烷酸甲酯（C20:0）/ 花生酸甲酯 Methyl Arachidate 1120-28-1二十二烷酸甲酯（C22:0）/ 山崳酸甲酯 Methyl Behenate 929-77-1十四碳烯酸甲酯（C14:1,順-9） Methyl Myristoleate 56219-06-8十五碳烯

10、酸甲酯（C15:1,順-10） Methyl Cis-10-Pentadecenoate十六碳烯酸甲酯（C16:1，順-9）/棕櫚油酸甲酯Methyl Palmitoleate 1120-25-8十七碳烯酸甲酯（C17:1，順-10） Methyl Cis-10-Heptadecenoate十八碳烯酸甲酯（C18:1,順-9）/油酸甲酯 Methyl Oleate 112-62-9十八碳烯酸甲酯（C18:1T,反-9）/反油酸甲酯 Methyl Elaidate 2462-84-2十八碳二烯酸甲酯（C18:2,順-9,12）/亞油酸甲酯 Methyl Linoleate 112-63-0十八碳

11、三烯酸甲酯（C18:3,順-9,12,15）/ -亞麻酸甲酯 Methyl Alpha-Linolenate十八碳三烯酸甲酯（C18:3,順-6,9,12）/ -Y麻酸甲酯 Methyl Gamma-Linolenate二十碳烯酸甲酯（C20:1T,反-11） Methyl Trans-11-Eicosenoate二十碳烯酸甲酯（C20:1，順-11）/花生一烯酸甲酯 Methyl Cis-11-Eicosenoate二十碳二烯酸甲酯（C20:2，順-11,14） Methyl Cis-11,14-Eicosadienoate二十碳三烯酸甲酯（C20:3，順-8,11,14） Methyl H

12、omo-Gamma-Linolenate二十碳三烯酸甲酯（C20:3，順-11,14,17） Methyl Cis-11,14,17-Eicosatrienoate二十碳四烯酸甲酯（C20:4,順-5,8,11,14）/花生四烯酸甲酯（ARA-M） Methyl Cis-5,8,11,14-Eicosatetraenoate二十二碳烯酸甲酯（C22:1，順-13）/順芥子酸甲酯 Methyl Erucate 1120-34-9二十二碳烯酸甲酯（C22:1T,反-13） Methyl Brassidate二十二碳二烯酸甲酯 （C22:2，順-13,16） Methyl Cis-13,16-Doc

13、osadienoate二十二碳六烯酸甲酯 （順-4,7,10,13,16,19）（DHA-M） Methyl Cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoate（Dha-M）二十四碳烯酸甲酯（C24:1，順-15）/神經(jīng)酸甲酯 Methyl Nervonate 2733-88-2結(jié)果的計(jì)算現(xiàn)在行業(yè)當(dāng)中有兩種計(jì)算方法其一是面積歸一 化法，那就是用百分比來計(jì)算的。別一種是內(nèi)標(biāo)法計(jì)算，個(gè)人覺得內(nèi)標(biāo)法更準(zhǔn)確一 點(diǎn)所以在些把內(nèi)標(biāo)法的計(jì)數(shù)公式列出來大家看 看：脂肪酸甲酯響應(yīng)因子RiPsiWc仙PSc11：oWi式中:Ri 脂肪酸甲酯i的響應(yīng)因子酸甲酯i的峰面積甲酯的峰面積的質(zhì)量一碳酸

14、甲酯的質(zhì)量甘油三酯重量Ps混標(biāo)中各脂肪PSC11:0 十一碳酸Wi 脂肪酸甲酯iWcii：o -混標(biāo)中十WFAMEiPti WtC11:0 1.0067PtC11:0RiWTG i WFAM Ei f TGi式中：WFAMEi 脂肪酸甲酯i的重量Wtcii：o 內(nèi)標(biāo)物卜一碳酸甲酯的重量Pti 脂肪酸甲酯 i 的峰面積PtC11:0 內(nèi)標(biāo)物十一碳酸甲酯的峰面積Ri 脂 肪 酸 甲 酯 i 響應(yīng)因子1.0067十一碳 酸甘油三酯轉(zhuǎn)換成十一碳酸甲酯的轉(zhuǎn)換 系數(shù)fTGi 脂肪酸甲酯 i 轉(zhuǎn)換成脂肪酸甘油三酯的系數(shù)樣品中總脂肪的含量Total fat, % ( WDTG /Wtest portion )式中：Total fat,% 樣品中總脂肪的含量， %Wtest portion 測試樣品重量 單個(gè)脂肪酸重量式中：fFAi 脂 肪 酸 甲酯轉(zhuǎn)換成脂肪酸轉(zhuǎn)換系數(shù) 飽和脂肪含量Saturated fat, % ( saturated Wt /Wtest portion ) 100%式中： Saturated Wi 飽和脂肪重量 單不飽和脂肪和多不飽和脂肪的含