島津LC-10AT型液相基礎(chǔ)知識

1、第一節(jié)第一節(jié) 島津島津LC-10AT型型HPLC操作規(guī)程操作規(guī)程Leo.xu 目的目的:規(guī)范島津規(guī)范島津LC-10AT型高效液相色譜儀的使用。型高效液相色譜儀的使用。范圍范圍:適用于島津適用于島津LC-10AT型高效液相色譜儀的使用。型高效液相色譜儀的使用。職責職責:質(zhì)檢員對本規(guī)程的實施負責。質(zhì)檢員對本規(guī)程的實施負責。一、一、 系統(tǒng)組成系統(tǒng)組成 本系統(tǒng)由本系統(tǒng)由2個個LC-10ATvp溶劑溶劑輸送泵輸送泵（分（分主主/A泵和副泵和副/B泵）、泵）、Rheodyne 7725i手動手動進樣進樣閥閥、SPD-10Avp紫外紫外-可見可見檢測器檢測器、N2000色譜色譜數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)工作站工作站和和電腦電

2、腦等組成，另外還包括打印機、等組成，另外還包括打印機、不間斷電源等輔助設(shè)備。不間斷電源等輔助設(shè)備。 二、二、 準備準備1 、準備所需的流動相，用合適的準備所需的流動相，用合適的0.45m濾膜濾膜過濾，超聲脫氣過濾，超聲脫氣20min。2 、根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的洗脫柱（注意方向）和定根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的洗脫柱（注意方向）和定量環(huán)。量環(huán)。3、 配制樣品和標準溶液（也可在平衡系統(tǒng)時配制），用合適配制樣品和標準溶液（也可在平衡系統(tǒng)時配制），用合適的的0.45m濾膜過濾。濾膜過濾。（注意腐蝕性與有機系的的溶劑）（注意腐蝕性與有機系的的溶劑）4 、檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是

3、否連接正檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正常。常。 接通電源，依次開啟不間斷接通電源，依次開啟不間斷電源電源、B泵泵、A 泵泵、檢測器檢測器，待泵，待泵和檢測器自檢結(jié)束后，打開打印機、電腦顯示器、主機，最后打開和檢測器自檢結(jié)束后，打開打印機、電腦顯示器、主機，最后打開色譜色譜工作站工作站。三、三、 開機開機四、四、 參數(shù)設(shè)定參數(shù)設(shè)定1、 波長設(shè)定波長設(shè)定：在檢測器顯示初始屏幕時，按在檢測器顯示初始屏幕時，按func鍵，用數(shù)字鍵輸入所需波長鍵，用數(shù)字鍵輸入所需波長值，按值，按Enter鍵確認。按鍵確認。按CE鍵退出到初始屏幕。鍵退出到初始屏幕。2 、流速設(shè)定：流速設(shè)定：在在A泵顯

4、示初始屏幕時，按泵顯示初始屏幕時，按func鍵，用數(shù)字鍵輸入所需的流速鍵，用數(shù)字鍵輸入所需的流速（柱在線時流速一般不超過（柱在線時流速一般不超過1ml/min），按），按Enter鍵確認。按鍵確認。按CE鍵退出。鍵退出。3 、流動相比例設(shè)定：流動相比例設(shè)定：在在A泵顯示初始屏幕時，按泵顯示初始屏幕時，按conc鍵，用數(shù)字鍵輸入流動鍵，用數(shù)字鍵輸入流動相相B的濃度百分數(shù)，按的濃度百分數(shù)，按Enter鍵確認。按鍵確認。按CE鍵退出。鍵退出。四、四、 參數(shù)設(shè)定參數(shù)設(shè)定4、 梯度設(shè)定梯度設(shè)定：4.1 ：在在A泵顯示初始屏幕時，按泵顯示初始屏幕時，按edit鍵，鍵，Enter鍵；鍵；4.2 ：用數(shù)字鍵輸

5、入時間，按用數(shù)字鍵輸入時間，按Enter鍵，重復(fù)按鍵，重復(fù)按func鍵選擇所需功能鍵選擇所需功能（FLOW設(shè)定流速，設(shè)定流速，BCNC設(shè)定流動相設(shè)定流動相B的濃度），按的濃度），按Enter鍵，用數(shù)鍵，用數(shù)字鍵輸入設(shè)定值，按字鍵輸入設(shè)定值，按Enter鍵；鍵；4.3： 重復(fù)上一步設(shè)定其它時間步驟；重復(fù)上一步設(shè)定其它時間步驟；4.4 ：用數(shù)字鍵輸入停止時間，重復(fù)按用數(shù)字鍵輸入停止時間，重復(fù)按func鍵直至屏幕顯示鍵直至屏幕顯示STOP，按，按Enter鍵。按鍵。按CE鍵退出。鍵退出。五、五、 更換流動相并排氣泡更換流動相并排氣泡1： 將將A/B管路的吸濾器放入裝有準備好的流動相的儲液瓶中；管路的

6、吸濾器放入裝有準備好的流動相的儲液瓶中；2 ：逆時針轉(zhuǎn)動逆時針轉(zhuǎn)動A/B泵的排液閥泵的排液閥180，打開排液閥；，打開排液閥；3 ：按按A/B泵的泵的purge鍵，鍵，pump指示燈亮，泵大約以指示燈亮，泵大約以9.9ml/min的流速沖的流速沖洗，洗，3min（可設(shè)定）后自動停止；（可設(shè)定）后自動停止；4 ：將排液閥順時針旋轉(zhuǎn)到底，關(guān)閉排液閥。將排液閥順時針旋轉(zhuǎn)到底，關(guān)閉排液閥。5 ：如管路中仍有氣泡，則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。如管路中仍有氣泡，則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。6 ：如按以上方法不能排盡氣泡，從柱入口處拆下連接管，放入廢液瓶中，如按以上方法不能排盡氣泡，從柱入口處拆下連接管，放

7、入廢液瓶中，設(shè)流速為設(shè)流速為5ml/min，按，按pump鍵，沖洗鍵，沖洗3min后再按后再按pump鍵停泵，重鍵停泵，重新接上柱并將流速重設(shè)為規(guī)定值。新接上柱并將流速重設(shè)為規(guī)定值。六、六、 平衡系統(tǒng)平衡系統(tǒng)1、查看基線查看基線：1.1：按按N2000色譜數(shù)據(jù)工作站操作規(guī)程色譜數(shù)據(jù)工作站操作規(guī)程打開打開“在線色譜工作站在線色譜工作站”軟件，軟件，1.2：輸入實驗信息并設(shè)定各項方法參數(shù)后，輸入實驗信息并設(shè)定各項方法參數(shù)后，1.3：按下按下“數(shù)據(jù)收集數(shù)據(jù)收集”頁的頁的 按鈕。按鈕。 六、六、 平衡系統(tǒng)平衡系統(tǒng)2 、等度洗脫方式等度洗脫方式 2.1 ：按按A泵的泵的pump鍵，鍵，A、B泵將同時啟動

8、，泵將同時啟動，pump指示燈亮。用指示燈亮。用檢驗方法規(guī)定的流動相沖洗系統(tǒng)，一般最少需檢驗方法規(guī)定的流動相沖洗系統(tǒng)，一般最少需6倍柱體積倍柱體積的流動相。的流動相。 2.2 ：檢查各管路連接處是否漏液，如漏液應(yīng)予以排除。檢查各管路連接處是否漏液，如漏液應(yīng)予以排除。 2.3 ：觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動應(yīng)觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動應(yīng)不超過不超過1MPa。如超。如超過則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按過則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按檢查管路后再檢查管路后再操作。操作。 2.4 ：觀察基線變化。如果沖洗至基線漂移觀察基線變化。如果沖洗至基線漂移0.01mV/min，噪聲為，噪聲

9、為25mmol/L25mmol/L的緩沖液的緩沖液4.4.每天沖洗柱每天沖洗柱5.5.穩(wěn)定進樣條件穩(wěn)定進樣條件, ,調(diào)節(jié)流動相調(diào)節(jié)流動相6.6.采用保護柱采用保護柱二、二、 保留時間縮短保留時間縮短 1.1.流速增加流速增加2.2.樣品超載樣品超載3.3.鍵合相流失鍵合相流失4.4.流動相組成變化流動相組成變化5.5.溫度增加溫度增加1.1.檢查泵檢查泵, ,重新設(shè)定流速重新設(shè)定流速2.2.降低樣品量降低樣品量3.3.流動相流動相PHPH值保持在值保持在37.537.5檢查柱的方向檢查柱的方向4.4.防止流動相蒸發(fā)或沉淀防止流動相蒸發(fā)或沉淀5.5.柱恒溫柱恒溫三、三、 保留時間延長保留時間延長

10、 1.1.流速下降流速下降2.2.硅膠柱上活性點變化硅膠柱上活性點變化3.3.鍵合相流失鍵合相流失4.4.流動相組成變化流動相組成變化5.5.溫度降低溫度降低1.1.管路泄漏管路泄漏, ,更換泵密封圈更換泵密封圈, ,排除泵內(nèi)氣泡排除泵內(nèi)氣泡2.2.用流動相改性劑用流動相改性劑, ,如加三如加三乙胺乙胺, ,或采用堿至鈍化柱或采用堿至鈍化柱3.3.流動相流動相PHPH值保持在值保持在37.537.5檢查柱的方向檢查柱的方向4.4.防止流動相蒸發(fā)或沉淀防止流動相蒸發(fā)或沉淀5.5.柱恒溫柱恒溫四四 、 出現(xiàn)肩峰或分叉出現(xiàn)肩峰或分叉 1.1.樣品體積過大樣品體積過大2.2.樣品溶劑過強樣品溶劑過強3

11、.3.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道4.4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效5.5.進樣器損壞進樣器損壞1.1.用流動相配樣用流動相配樣, ,總的樣品體積小于第一峰總的樣品體積小于第一峰的的15%15%2.2.采用較弱的樣品溶劑采用較弱的樣品溶劑3.3.更換色譜柱更換色譜柱, ,采用較弱腐蝕性條件采用較弱腐蝕性條件4.4.更換燒結(jié)不銹鋼更換燒結(jié)不銹鋼, ,加在線過濾器加在線過濾器, ,過濾樣品過濾樣品5.5.更換進樣器轉(zhuǎn)子更換進樣器轉(zhuǎn)子五、五、 鬼峰鬼峰 1.1.進樣閥殘余峰進樣閥殘余峰2.2.樣品中未知物樣品中未知物3.3.柱未平衡柱未平衡4.4.三氟乙酸三氟乙酸(TFA)(T

12、FA)氧化氧化( (肽譜肽譜) )5.5.水污染水污染( (反相反相) )1.1.每次用后用強溶劑清洗閥每次用后用強溶劑清洗閥, ,改進閥和樣品的改進閥和樣品的清洗清洗2.2.處理樣品處理樣品3.3.重新平衡柱重新平衡柱, ,用流動相作樣品溶劑用流動相作樣品溶劑 ( (尤其是尤其是離子對色譜離子對色譜) )4.4.每天新配每天新配, ,用抗氧化劑用抗氧化劑5.5.通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用HPLCHPLC級級的水的水六、六、 基線噪聲基線噪聲 1.1.氣泡氣泡( (尖銳峰尖銳峰) )2.2.污染污染( (隨機噪聲隨機噪聲) )3.3.檢測器燈連續(xù)噪聲檢測器燈連

13、續(xù)噪聲4.4.電干擾電干擾( (偶然噪聲偶然噪聲) )5.5.檢測器中有氣泡檢測器中有氣泡1.1.流動相脫氣流動相脫氣, ,加柱后背壓加柱后背壓2.2.清洗柱清洗柱, ,凈化樣品凈化樣品, ,用用HPLCHPLC級試劑級試劑3.3.更換氘燈更換氘燈4.4.采用穩(wěn)壓電源采用穩(wěn)壓電源, ,檢查干擾的檢查干擾的來源來源( (如水浴等如水浴等) )5.5.流動相脫氣流動相脫氣, ,加柱后背壓加柱后背壓七、七、 峰拖尾峰拖尾 1.1.柱超載柱超載2.2.峰干擾峰干擾3.3.硅羥基作用硅羥基作用4.4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效5.5.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道6.6.死體積或柱外

14、體積過大死體積或柱外體積過大7.7.柱效下降柱效下降1.1.降低樣品量降低樣品量, ,增加柱直徑采用較高容量的固定相增加柱直徑采用較高容量的固定相2.2.清潔樣品清潔樣品, ,調(diào)整流動相調(diào)整流動相3.3.加三乙胺加三乙胺, ,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相低流動相PHPH值值, ,鈍化樣品鈍化樣品4.4.更換燒結(jié)不銹鋼更換燒結(jié)不銹鋼, ,加在線過濾器加在線過濾器, ,過濾樣品過濾樣品5.5.更換色譜柱更換色譜柱, ,采用較弱腐蝕性條件采用較弱腐蝕性條件6.6.連接點降至最低連接點降至最低, ,對所有連接點作合適調(diào)整對所有連接點作合適調(diào)整, ,盡可能

15、盡可能采用細內(nèi)徑的連接管采用細內(nèi)徑的連接管7.7.用較低腐蝕條件用較低腐蝕條件, ,更換柱更換柱, ,采用保護柱采用保護柱八、八、峰展寬峰展寬 1.1.進樣體積過大進樣體積過大2.2.在進樣閥中造成峰擴展在進樣閥中造成峰擴展3.3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢4.4.檢測器時間常數(shù)過大檢測器時間常數(shù)過大1. 1. 用流動相配樣用流動相配樣, ,總的樣品體積小總的樣品體積小于第一峰的于第一峰的15%15%2.2.進樣前后排出氣泡以降低擴散進樣前后排出氣泡以降低擴散3.3.設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于1010點點4.4.設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的半寬的10%10%八、八、峰展寬峰展寬5.