Survivin特異性shRNA表達載體的構(gòu)建及評價

1、Survivin特異性shRNA表達載體的構(gòu)建及評價【摘要】 目的 構(gòu)建針對人結(jié)腸癌細胞系Lovo的高效率沉默Survivin的shRNA表達載體。方法 合成特異性干擾Survivin的小發(fā)卡RNA（shRNA）片段，并與pGenesil2 載體連接，構(gòu)建Survivin干擾載體（pGenesil2Survivin shRNA）。利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染Lovo細胞，分為正常細胞對照組和3個shRNA干擾組（pGenesil2Survivin1、2及3），應用熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染效果進行評價，應用Western印跡和免疫細胞化學法分析轉(zhuǎn)染后Lovo中Survivin的蛋白表達水平。結(jié)果 插入片段測序結(jié)果

2、與合成shRNA結(jié)果一致；轉(zhuǎn)染效率可達70%左右，轉(zhuǎn)染pGenesil2Survivin shRNA后，3個干擾組的Lovo細胞中Survivin蛋白表達水平均較正常對照組顯著降低（P0.01）。結(jié)論 成功構(gòu)建了能高效沉默Survivin的RNAi表達載體；且pGenesil2Survivin高效抑制結(jié)腸癌Lovo細胞中Survivin基因表達。 【關(guān)鍵詞】 RNA干擾；生存素；結(jié)腸癌；shRNA研究顯示，Survivin 在人結(jié)腸癌組織以及細胞系中存在高表達，并與人結(jié)腸癌的形成和演進存在密切關(guān)系，其作用機制可能涉及促進結(jié)腸癌惡性增殖及抗細胞凋亡等多個方面1，2。因此，靶向Survivin的研

3、究對明確結(jié)腸癌的發(fā)病及轉(zhuǎn)移機制以及提高結(jié)腸癌的療效均有重要意義35。故本研究利用pGenesil2真核表達載體構(gòu)建了含高效的靶向Survivin基因的重組載體pGenesil2Survivin shRNA，并進一步應用其沉默人結(jié)腸癌系Lovo的Survivin基因，為探討Survivin 在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及應用其進行結(jié)腸癌的基因治療奠定實驗室基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 材料 感受態(tài)細胞DH5為我室保存。干擾載體pGenesil1和pGenesil2購自晶賽公司（pGenesil1載體為帶有熒光蛋白EGFP基因的pGenesil2序列）。質(zhì)粒DNA純化試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購自Qi

4、agen公司（荷蘭）。所用的酶BamH、Hind、T4 DNA 連接酶、Sal和Pst均購自Takara公司（日本）。 1.2 Survivin shRNA表達載體構(gòu)建及鑒定 由Genbank查到Survivin的cDNA序列，根據(jù)Ambion公司在線設(shè)計軟件，篩選3個長度均為19 bp的靶定序列，分別為：模板1、2和3分別為正義5GGACCACCGCATCTCTACA3，反義5TGTAGAGATGCGGTGGTCC3；正義5GCATTCGTCCGGTTGCGCT3，反義5AGCGCAACCGGACGAATGC3；正義5GGCTGGCTTCATCCACTGC3；反義5GCAGTGGATGAAG

5、CCAGCC3的靶基因序列。設(shè)計3對寡核苷酸序列設(shè)計引物。引物結(jié)構(gòu)：在設(shè)計的寡核苷酸鏈中，其兩端分別為BamH和Hind的酶切位點，能與線性化載體直接相連，中間的9 個堿基為形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的環(huán)區(qū)，以上序列由上海生工公司合成。線性化pGgenesil2質(zhì)粒：載體pGenesil2經(jīng)BamH和Hind雙酶切，1瓊脂糖凝膠回收大片段。發(fā)卡shRNA寡核苷酸鏈的退火：用50 l 退火緩沖液分別溶解上述合成的寡核苷酸片段。各取2 l（即2 l 正義鏈+2 l 反義鏈）+16 l 退火緩沖液混勻。94水浴退火自然冷卻至室溫。取1 l退火產(chǎn)物+99 l H2O做100倍稀釋。重組載體pGenesil2Surv

6、ivin shRNA的構(gòu)建：T4 DNA連接酶連接退火寡核苷酸鏈與線性化載體pGenesil2，建立10 l連接反應體系：取稀釋退火寡核苷酸鏈1 l，線性化pGenesil2質(zhì)粒載體1 l，10連接酶緩沖液 1 l，T4 DNA連接酶1 l，H2O 6 l，22水浴反應過夜。細菌轉(zhuǎn)化與質(zhì)粒提?。喝? l過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5，涂布于含Kana抗性（終濃度為30 mg/L）的LB平板上，37恒溫箱培養(yǎng)過夜。從培養(yǎng)皿上挑取3個單克隆菌落接種于3 ml含Kana抗性（終濃度為30 mg/L）的LB培養(yǎng)液中，37恒溫搖床（250 r/min）培養(yǎng)過夜。用小提試劑盒小量提取質(zhì)粒。重組載體的酶切

7、鑒定：質(zhì)粒分別用Pst和Sal做酶切鑒定，反應條件為：質(zhì)粒DNA 8 l，10緩沖液 1 l，Pst和Sal酶各1 l；37水浴反應3 h，1%瓊脂糖凝膠電泳；送北京英俊公司測序。 1.3 pGenesilSurvivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌Lovo細胞轉(zhuǎn)染效率的測定 將Lovo細胞鋪于覆有蓋玻片的6孔板內(nèi)，接種密度約為5105個/孔。24 h后換液，用脂質(zhì)體Lipo 2000轉(zhuǎn)染含有熒光發(fā)光基因EGFP的pGenesil1載體及pGenesil2Survivin shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染前12 h換為無雙抗的DMEM培養(yǎng)基，然后用無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后換為含有10

8、%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后48 h蓋玻片用熒光顯微鏡分別觀察轉(zhuǎn)染情況。 1.4 pGenesil2Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌Lovo細胞干擾效果的測定 實驗分為4組，分別為正常細胞對照組、pGenesil2Survivin shRNA1、2以及3組，每組設(shè)4復孔。Western印跡檢測：收集細胞，用0.01 mmol/L PBS緩沖液漂洗3次后加入200 l細胞裂解液混勻、冰浴30 min。15 000 r/min離心10 min后，以Lowry法行總蛋白定量分析。制備12分離膠、5積層膠。按計算好的樣品量上樣，使各組上樣量相等，在8 V/era電壓條件下行SDS聚丙

9、烯酰胺電泳，待溴酚藍進入分離膠時，將電壓提高到15 V/era。電泳結(jié)束后，將SDS分離出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上（Millipore,USA）。以含5脫脂奶粉的TBS溶液封閉2 h，PTTG鼠抗人單克隆一抗和actin室溫孵育2 h，相應的二抗室溫孵育1.5 h，ECL 試劑盒顯色，拍照。 2 結(jié) 果 2.1 重組載體測序結(jié)果 pGenesil2Survivin1、2和3的測序結(jié)果顯示，設(shè)計的3對shRNA片段均已成功地連入pGenesil2載體中，即重組載體pGenesil2Survivin shRNA均構(gòu)建成功。 2.2 pGenesil2Survivin shRNA載體轉(zhuǎn)染Lovo

10、細胞轉(zhuǎn)染效率的測定 應用與載體pGenesil2具有基本具有相同序列的pGenesil1載體（pGenesil1中比pGenesil2只多出EGFP蛋白的序列）測定轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后測定Lovo細胞轉(zhuǎn)染效率結(jié)果顯示，正常細胞對照組熒光表達百分率約為8%，轉(zhuǎn)染組熒光表達百分率為70%（圖1）。即Lovo細胞的轉(zhuǎn)染效率約為62%，已經(jīng)可以滿足實驗需要。 圖1 熒光顯微鏡下觀察Lovo細胞轉(zhuǎn)染 2.3 pGenesil Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Lovo細胞干擾的檢測 通過Western印跡測定干擾后Lovo細胞中Survivin蛋白表達情況，pGenesil Survivin sh

11、RNA1、2和3轉(zhuǎn)染Lovo細胞中Survivin蛋白表達干擾效率分別為78%、65.2%和69.3%（圖2）。 圖2 轉(zhuǎn)染pGenesil Survivin shRNA質(zhì)粒后 Lovo細胞Survivin表達情況 3 討 論 RNAi介導的特異性同源基因mRNA降解的一種細胞反應過程，是轉(zhuǎn)錄后基因沉默(pTGs)的一種形式。RNAi首先由Fier等人于1998年發(fā)現(xiàn)并命名6。目前已發(fā)現(xiàn)RNAi具有多方面的顯著特點79：高特異性，siRNA引起同源基因mRNA的降解具有高度的特異性，因為即使一個堿基的改變往往就會大大降低甚至完全喪失siRNA對靶基因的抑制作用；高效性，RNAi過程一旦被啟動，

12、反應信號就可以被一定程度地擴增和放大，最低每個細胞內(nèi)一份拷貝的siRNA就足以達到基因抑制的效果；高穩(wěn)定性，通過采用RNAi對線蟲全基因組功能進行分析的結(jié)果顯示，其中50%80%的序列選擇有效，12.9%27%的基因抑制產(chǎn)生了明顯的異常表型，因此RNAi作用具有很高的成功率和穩(wěn)定性。此外，RNAi還具有研究周期短、操作簡單等突出優(yōu)點。由于RNAi所具有的上述重要特點，使得它在發(fā)現(xiàn)后迅速地發(fā)展并展示了其在生命科學研究中有極其廣闊的應用前景。RNAi的主要應用方向包括8，10，11：研究基因功能，在后基因組時代規(guī)模性的基因功能研究中，通過RNAi特異性抑制基因的表達可獲得特定蛋白功能喪失或降低的突

13、變體，從而借以闡明特定基因在生物體中的功能。疾病基因治療，由于RNAI可以特異性和高效性地抑制基因的表達，毋庸置疑，它將在遺傳病、病毒感染和癌癥等人類多種頑固性疾病的基因治療中發(fā)揮重要的作用。新藥物研究和開發(fā)，RNAi可用作尋找新的藥物靶標的有效工具，可高通量地對發(fā)現(xiàn)的藥物靶基因做功能分析，還可以幫助了解藥物作用的生化模式等等。正是由于RNAi在生命科學研究中所具有的重大意義，因此將RNAi技術(shù)應用到結(jié)腸癌的基因治療中，在治療策略上或進行多基因聯(lián)合治療，或傳統(tǒng)治療與基因治療聯(lián)合應用，惡性結(jié)腸癌的基因治療有望產(chǎn)生突破性進展。 本實驗表明所構(gòu)建的pGenesil2質(zhì)粒載體可有效沉默Lovo細胞中的

14、Survivin基因表達。數(shù)據(jù)對比分析可以發(fā)現(xiàn)，所合成的3組干擾質(zhì)粒載體中，Survivin shRNA1組干擾效率最高，對Lovo細胞中Survivin蛋白的沉默效率可以達到70%以上，可作為下一步分析研究的優(yōu)選載體?！緟⒖嘉墨I】 1 Okon K,Demczuk S,Klimkowska A,et al.Correlation of microsatellite status,proliferation,apoptotic and selected immunohistochemical markers in colorectal carcinoma studied with tissue

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