P糖蛋白Survivin蛋白在卵巢上皮性癌中的表達及其與卵巢癌耐藥的關(guān)系

1、P-糖蛋白、Survivin蛋白在卵巢上皮性癌中的表達及其與卵巢癌耐藥的關(guān)系【摘要】 目的 檢測抑凋亡蛋白Survivin及多藥耐藥基因mdr1的表達蛋白P糖蛋白(Pgp)在卵巢上皮性癌中的表達，分析其在卵巢癌化學(xué)治療耐藥中的作用及與臨床病理學(xué)特征間的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)SP法檢測8例正常卵巢組織、16例良性上皮性卵巢腫瘤、46例上皮性卵巢癌(漿液性癌28例、粘液性癌12例、內(nèi)膜樣癌6例)組織中的Survivin、Pgp蛋白的表達情況。結(jié)果 Survivin、Pgp蛋白在卵巢癌組織中陽性表達率分別為60.9%和34.8%，顯著高于良性上皮性卵巢腫瘤組織31.3%、0%和正常卵巢組織

2、(陰性)(P<0.05)。Survivin蛋白在-期惡性上皮性卵巢腫瘤組中的陽性表達高于-期腫瘤組(P<0.05)；在低分化惡性上皮性卵巢腫瘤組織中的陽性表達高于中、高分化腫瘤組，有顯著性差異(P<0.05)，但與腫瘤組織類型無關(guān)。Survivin與Pgp在惡性上皮性卵巢腫瘤組中存在共同表達，卡方檢驗P<0.05，呈正性相關(guān)。結(jié)論 卵巢癌存在原發(fā)性耐藥，而由Survivin高表達引起的凋亡抑制在卵巢癌多藥耐藥的發(fā)生中起一定作用。 【關(guān)鍵詞】 卵巢腫瘤；多藥耐藥；P-糖蛋白；Survivin蛋白；免疫組織化學(xué)The expression o

3、f survivin and Pgp proteinsin epithelial ovarian carcinoma and its relationship withmultidrug resistance in ovarian carcinomaABSTRACT: Objective To detect the expression of inhibitor of apoptosis protein survivin and mdr1 gene protein Pgp in ovarian epithelial carcinoma, and analyze their functions

4、of drug resistance in chemotherapy and the relationship with pathological characteristics. Methods We detected the expression of survivin and mdr1 proteins in 8 cases of normal ovarian tissues, 16 cases of benign epithelial ovarian tumor tissues and 46 cases of epithelial ovarian cancerous tissues (

5、28 cases of serous cystadenocarcinoma, 12 cases of mucinous cystadenocarcinoma, and 6 cases of endometrioid carcinoma) with immunohistochemistry. Results The positive rate of survivin and mdr1 proteins in ovarian cancerous tissues was 60.9% and 34.8%, respectively, which was significantly higher tha

6、n that in benign epithelial ovarian tumor tissues (31.3% and 0%) and normal ovarian tissues (negative) (P<0.05).In epithelial ovarian carcinoma group, the level of survivin expression in stage - was significantly higher than that in stage , and the positive rate in low differential epithelial

7、 ovarian carcinoma tissues was higher than in medium and high differential epithelial ovarian carcinoma tissues (P<0.05). There was no significant difference among different pathological types. There was coexpression of survivin and mdr1 in ovarian epithelial carcinoma, and positive correlati

8、on was seen for survivin and mdr1 in chisquare test. Conclusion Primary drug resistance exists in ovarian carcinoma. The abnormal survivin gene expression in ovarian cancerous tissues might induce apoptosis suppression, which might play a role in primary drug resistance and multiple drug resistance

9、in ovarian carcinoma chemotherapy.KEY WORDS: ovarian neoplasm; multidrug resistance; Pgp; survivin; immunohistochemistry卵巢癌化學(xué)多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)的研究既是熱點問題，又是難點問題。目前認為多藥耐藥基因mdrl的表達產(chǎn)物P糖蛋白(Pgp)高表達是產(chǎn)生MDR的主要原因，Pgp是化療耐藥的最有力的指標(biāo)，可用于預(yù)測腫瘤患者耐藥1。而最新研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞對凋亡的敏感性也是影響化療效果的關(guān)鍵因素，本文旨在研究產(chǎn)生耐藥的這兩種不同機理之間內(nèi)在聯(lián)

10、系，為探明腫瘤細胞多藥耐藥的詳盡機制提供一些實驗依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料來源及分組 選取本院1999年1月至2004年8月送檢的卵巢癌手術(shù)標(biāo)本存檔蠟塊46例，組織學(xué)類型：漿液性囊腺癌27例，黏液性囊腺癌13例，子宮內(nèi)膜樣癌6例；病理分化程度：中、高分化組22例，低分化組24例；臨床分期按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)，1986年：、期10例，、期36例。標(biāo)本經(jīng)病理診斷證實。正常卵巢組織8例(因婦科良性疾病在本院手術(shù)切除)，卵巢良性上皮性腫瘤16例(漿液性囊腺瘤9例，黏液性囊腺瘤5例，子宮內(nèi)膜樣腫瘤2例)。所有患者年齡為28-74歲，平均年齡52.4歲?；颊呔鶠槌醮问中g(shù)，術(shù)前未接受任何治

11、療，無乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及胃腸道腫瘤，無卵巢惡性腫瘤家族史。三組病例患者的年齡、身高、體重、職業(yè)、有無吸煙、孕次、產(chǎn)次及發(fā)病時間均無顯著差異。1.2 試劑 鼠抗人Pgp單克隆抗體JSB1及鼠抗人SurvivinAb2多克隆抗體SC10811均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。1.3 方法 采用鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶連接(SP)法免疫組織化學(xué)檢測。標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，5m連續(xù)切片。將切片常規(guī)脫蠟，浸入pH為6.0濃度為0.01mol/L枸櫞酸緩沖液，微波修復(fù)抗原后入蒸餾水新鮮配制的3%(體積分數(shù))H2O2，室溫孵育10min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20mi

12、n。分別滴加鼠抗人Pgp單克隆抗體或鼠抗人SurvivinAb2多克隆抗體(鼠IgG1)，濃度均為150，4過夜。37孵育1h。滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，37孵育45min。滴加生物素化辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉素，37孵育30min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，樹膠封片。陽性對照用已知陽性染色乳腺癌切片，陰性對照用磷酸鹽緩沖液代替一抗。1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS10.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計教研室)進行列表卡方、Fisher確切概率法以及CC(contingency coefficient)計算列系數(shù)、KAPPA法描述相關(guān)性，以P&am

13、p;lt;0.05為顯著差異水平。2 結(jié)果2.1 結(jié)果判定 隨機選擇高倍鏡(×40)10個視野，觀察陽性表達。Pgp陽性為細胞膜上棕黃色染色；Survivin陽性為胞漿中淡黃色至棕黃色。陽性數(shù)<30%或僅少數(shù)細胞呈黃至棕色染色者定為弱陽性(+)；>70%細胞呈黃至棕色染色者定為強陽性()；介于之間者為中度陽性()；染色強度與背景無明顯差別者為陰性。2.2 免疫組化染色結(jié)果 Pgp蛋白及Survivin蛋白陽性表達的染色部位主要分別位于腫瘤細胞膜及胞漿，均為棕黃色顆粒狀。圖1(AF)均為彌漫性或局灶性分布。2.3 Pgp、Survivin蛋白在正常、良性及惡

14、性卵巢上皮性腫瘤中的表達比較 Pgp在正常卵巢和良性腫瘤組織中均為陰性，46例卵巢癌組織中陽性表達16例，陽性率、過表達率(即中度以上陽性例數(shù)占總數(shù)的百分率)高于良性組，P<0.05，皆有顯著性差異(表1)。表1 Pgp蛋白在不同組織中的表達（略）Table 1 Expression of Pgp in different tissues*P<0.05 vs. normal Survivin蛋白在正常卵巢組織中未發(fā)現(xiàn)陽性表達；在16例良性上皮性卵巢腫瘤中，陽性率及過表達率與正常卵巢組相比較，F(xiàn)isher確切概率法P=0.130，無顯著性差異；46例卵巢上皮性癌組織中

15、表達陽性28例，陽性率及過表達率高于良性組，P<0.05，皆有顯著性差異(表2)。表2 Survivin蛋白在不同組織中的表達（略）Table 2 Expression of survivin in different tissuesP<0.05 vs. benign tissues; P<0.05 vs. normal圖1 Survivin與Pgp在不同卵巢組織中的表達（略）Fig.1 Survivin and Pgp staining in the different ovarian tissues (SP×400)A, D: benig

16、n epithelial ovarian tumor; B, E: high differential epithelial ovarian carcinoma tissues; C, F: low differential epithelial ovarian carcinoma tissues2.4 Pgp及Survivin在卵巢上皮性癌患者臨床病理因素的相關(guān)性分析 Pgp表達與卵巢上皮性癌中各臨床病理參數(shù)即手術(shù)臨床分期、組織學(xué)類型、病理分級均無關(guān)，P>0.05(表3)。表3 Pgp蛋白表達與卵巢上皮性癌患者各臨床病理因素的關(guān)系（略）Table 3 Association b

17、etween clinicopathologic variables and Pgp expressionP<0.05 vs. - stage; P<0.05 vs. medium/high differentiation Survivin蛋白在卵巢上皮性癌中的表達與臨床分期、組織學(xué)類型有關(guān)，而與病理類型無關(guān)。-期腫瘤Survivin蛋白表達水平、強度高于-期，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；低分化腫瘤Survivin蛋白表達水平、強度都高于中、高分化的腫瘤，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。2.5 惡性卵巢上皮性腫瘤組織中Surv

18、ivin蛋白和Pgp陽性表達的相關(guān)性分析 Pgp在Survivin陽性組中的表達率為60.71%(17/28)，在Survivin陰性組中的表達率為27.78%(5/18)，兩者之間有統(tǒng)計學(xué)差異(2=0.785，P=0.008)，Survivin和Pgp的表達呈正性相關(guān)。表4 Survivin的表達與卵巢上皮性癌患者各臨床病理因素的關(guān)系（略）Table 4 Association between clinicopathologic variables and survivin expressionP<0.05 vs. - stage; P<0.05 vs. medi

19、um/high differentiation3 討論 Pgp是多藥耐藥基因mdr1的表達產(chǎn)物，為ATP依賴型的藥物外排泵，當(dāng)化療藥物進入瘤細胞，Pgp將結(jié)構(gòu)、作用機制不同的化療藥物結(jié)合并將其排出細胞，以維持細胞內(nèi)藥物濃度低于細胞毒水平，從而阻礙化療藥物作用的發(fā)揮，使瘤細胞耐藥，其表達水平與耐藥程度成正相關(guān)2。本研究Pgp在正常卵巢和卵巢良性腫瘤中未見陽性表達，說明卵巢并非Pgp的富集器官。本研究中46例卵巢上皮性癌組織中，即使未接觸過化療藥，仍有16例Pgp表達陽性，說明Pgp基因表達除可被藥物、放射線誘導(dǎo)產(chǎn)生外還有可能是卵巢惡性腫瘤所固有的表達，可能由于癌基因和抑癌基因改變使mdr1基因活

20、化3。但Pgp在46例卵巢上皮性癌組織中表達率僅34.8%，表達量較低，這提示Pgp在卵巢癌原發(fā)性耐藥機制中并不起主導(dǎo)作用4。 結(jié)構(gòu)不同、作用靶點各異的抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)瘤細胞凋亡，凋亡受抑制可產(chǎn)生化療藥物耐藥。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族中的一個成員,是至今發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子，通過直接或間接抑制caspase 3和caspase 7活性抑凋亡5，也可對抗廣泛的凋亡誘導(dǎo)因素，如IL3缺失、Fas的激活，Bax、caspase 3、7、8和TNF的過表達，包括對抗由化療藥物引起的凋亡，產(chǎn)生耐藥6。Tetsuhis

21、a等7研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)反義Survivin轉(zhuǎn)導(dǎo)直腸癌細胞株，出現(xiàn) Survivin表達下調(diào)，細胞增殖減少、凋亡增加，同時細胞對化療藥物敏感性增加。因此腫瘤細胞對化療藥物的敏感性可能與Survivin的表達直接相關(guān)。本研究得出Survivin在卵巢良性上皮性腫瘤中表達陽性率僅31.3%，而在癌組織中表達陽性率為60.9%，且其表達強度與臨床分期、組織學(xué)分級呈顯著相關(guān)，提示涉及Survivin的抗凋亡途徑紊亂在卵巢上皮性癌發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，也使細胞降低對化療藥物的敏感性產(chǎn)生耐藥，從而揭示卵巢癌易產(chǎn)生耐藥可能與化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的能力被抑制有關(guān)。但具體機制有待進一步研究。 本研究結(jié)果提示Su

22、rvivin和Pgp的表達呈正相關(guān)，表明卵巢癌組織中存在原發(fā)的耐藥基因與抑制凋亡基因的共同表達現(xiàn)象。最新研究表明，Pgp可能參與了凋亡的過程。Pawlik等8利用Pgp抑制劑維拉帕米和Pgp特異性單克隆抗體可使化療藥物誘導(dǎo)凋亡減少。由于二者的相關(guān)性在國內(nèi)外鮮有研究，二者共同調(diào)節(jié)機制仍需進一步探討。共同表達是耐藥相關(guān)基因受共同因子調(diào)控的證據(jù)。從一個側(cè)面反映了卵巢癌多藥耐藥機制的復(fù)雜性，這也是卵巢癌多年來化療未取得實質(zhì)性進展的重要原因，同時亦為耐藥逆轉(zhuǎn)劑的研究提出新的課題?！緟⒖嘉墨I】 1Sally P, Wheatley, Iain A, et al. Survivin: A protein w

23、ith dual roles in mitosis and apoptosis J. Inte Rev of Cytol, 2005, 247:3588.2Walker J, Martin C , Callaghan R. Inhibition of Pglycoprotein function by XR9576 in a solid tumour model can restore anticancer drug efficacy J. Euro J Cancer, 2002, 40(4):594605.3Jason Z, John J, Mandeep B, et al. Enhance

24、d cellular accumulation of a Pglycoprotein substrate, rhodamine123, by caco2 cells using low molecular weight methoxypolyethylene glycolblockpolycaprolactone diblock copolymers J. Euro J Phar and Biopharmaceutics, 2002, 54(3):299309. 4Julio ED, Enrich C, Xavier GDM, et al. Expression of multidrug resistance proteins pglycoprotein, multidrug resistance protein 1, breast cancer resistance protein and lung resistance related protein in locally advanced bladder cancer treated with neoadju