鎢酸鋰抑制β淀粉樣蛋白分泌及神經(jīng)元的保護作用研究

1、鎢酸鋰抑制淀粉樣蛋白分泌及神經(jīng)元的保護作用研究                        作者：侯軍代 路露 張曉裕 羅煥敏【摘要】  目的 研究鎢酸鋰對人淀粉樣前體蛋白及早老素1（M146L）細(xì)胞分泌淀粉樣蛋白（A142）的影響及其對體外培養(yǎng)新生小鼠大腦皮層神經(jīng)元的保護作用。方法 體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)染AD相關(guān)基因、可分泌A142的M146L細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加入低、中、高

2、劑量（3.1、5、8 mmol/L）鎢酸鋰或陽性對照藥，通過對M146L細(xì)胞活性及培養(yǎng)基中A142含量的測定，研究鎢酸鋰對M146L細(xì)胞分泌A142的影響。體外無血清培養(yǎng)新生小鼠大腦皮層神經(jīng)元，采用NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進行神經(jīng)元鑒定；觀察神經(jīng)元突起生長狀況，分析研究鎢酸鋰對大腦皮層神經(jīng)元的神經(jīng)保護作用。結(jié)果 低、中、高劑量鎢酸鋰對M146L均無細(xì)胞毒性；低、中、高劑量鎢酸鋰可抑制M146L細(xì)胞分泌A142；原代培養(yǎng)的新生小鼠大腦皮層神經(jīng)元，經(jīng)NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色被染成棕褐色的細(xì)胞占絕大多數(shù)，表明所培養(yǎng)細(xì)胞基本為神經(jīng)元；除低濃度（0.008 mmol/L）外，終濃度分別為0.2，0.04

3、mmol/L的鎢酸鋰均能明顯使突起數(shù)目和長度增加，可促進神經(jīng)元的存活。結(jié)論 適量的鎢酸鋰可抑制M146L細(xì)胞分泌A142；對新生小鼠大腦皮層神經(jīng)元具有神經(jīng)保護作用。 【關(guān)鍵詞】  鎢酸鋰；阿爾茨海默??；M146L細(xì)胞；淀粉樣蛋白；神經(jīng)保護作用【Abstract】  Objective  To explore the effects of lithium tungstate (LT) on the secretion of amyloid betaprotein 142（A142）of  M146L and the neuropretection on n

4、eurons from cerebral cortex of newborn mouse in vitro. Methods  M146L cells were culture by low, middle and high dose of LT or positive control drug and the cell activity and the content of A142 were detected. The neurons from cerebral cortex of newborn mouse were cultured in B27supplemented ne

5、urobasal, a new serumfree medium combination, and identified by NSE staining; MTT assay was carried out to investigate the effect of the LT on development of neurons. Results  Different concentrations of LT had no influence on the survival of M146L cells； Different concentrations of LT could in

6、hibit the secretion of A142 by M146L cells；Most of the neurons were stained to be positive with NSE, which suggested them being neurons; The results showed that LT (0.04 mmol/L, or 0.2 mmol/L) could increase the number and the length of neurites as well as the number of survival neurons. Conclusions

7、  Adequate LT could inhibit the secretion of A142 by M146L cells and has a neuroprotective effect on the neurons from cerebral cortex of newborn mouse.    【Key words】  Lithium tungstate; Alzheimers disease; Amyloid betaprotein; M146L cells; Neuroprotective effect淀粉樣蛋白（A142）生

8、成抑制劑是目前阿爾茨海默?。ˋD）藥物研發(fā)的重要方向，這類藥物大多仍處于實驗研究階段，個別進入臨床研究。近年研究表明，氯化鋰具有神經(jīng)保護作用，可拮抗多種因素誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，在一定程度上促進神經(jīng)元發(fā)生1。Phiel等研究發(fā)現(xiàn)氯化鋰可通過抑制GSK3而減少A分泌2。同時，有研究發(fā)現(xiàn)鎢酸鈉亦是一種GSK3抑制劑3，并且與氯化鋰合用具有協(xié)同作用4。因此，作者設(shè)想將氯化鋰和鎢酸鈉經(jīng)化學(xué)方法合成鎢酸鋰，其作用可能更優(yōu)。本實驗通過鎢酸鋰與前幾種試劑對神經(jīng)元作用的對比來驗證這一假說，并探尋一種更佳的A142生成抑制劑。鎢酸鋰為本實驗室首次合成，也是國內(nèi)外首次探討鎢酸鋰對A表達的影響，具有自主知識產(chǎn)權(quán)（專利號

9、：ZL200710027721.1）。     1  材料與方法1.1  材料1.2  實驗方法圖1  體外培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元的鑒定(NSE，×250)（略） 1.3  統(tǒng)計學(xué)處理  數(shù)據(jù)均以x±s表示，使用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。2  結(jié)果2.2  鎢酸鋰對M146L細(xì)胞分泌A142的影響  見表1。氯化鋰、鎢酸鈉、氯化鋰+鎢酸鈉和鎢酸鋰組對A142分泌均有抑制作用。鎢酸鋰抑制A142分泌呈一定的量效關(guān)系。表1  鎢酸

10、鋰對M146L細(xì)胞分泌A142的影響（略）與空白對照組比較:1)P0.05，2)P0.01；下表同表2  鎢酸鋰對培養(yǎng)48 h大腦皮層神經(jīng)元的影響（略）2.3  鎢酸鋰對小鼠皮層神經(jīng)元突起長度和突起數(shù)量的影響  如表2所示，rhbFGF組與空白對照組相比，突起數(shù)目、突起長度均有顯著性增加；氯化鋰和鎢酸鈉組與空白對照組相比突起數(shù)目無顯著性差異，但氯化鋰組與空白對照組相比突起長度有顯著性增加；氯化鋰鎢酸鈉組與空白對照組相比，突起數(shù)目、突起長度均有顯著性增加。低濃度鎢酸鋰組與空白對照組相比，突起數(shù)目、突起長度均無顯著性差異；中濃度鎢酸鋰組與空白對照組相比，突起數(shù)目無顯著

11、性差異，突起長度有顯著性增加；而高濃度鎢酸鋰組與空白對照組相比，突起數(shù)目、突起長度均有顯著性增加；但高濃度鎢酸鋰的作用尚不及rhbFGF，但優(yōu)于除rhbFGF組外的其他各組。新生小鼠大腦皮層神經(jīng)元經(jīng)鎢酸鋰處理48 h后，低濃度鎢酸鋰組和空白對照組相似，細(xì)胞生長較差，以單極、雙極神經(jīng)元為主，突起短，形成密集交叉網(wǎng)絡(luò)的較少；中濃度鎢酸鋰組，伸出突起的細(xì)胞明顯多于空白對照組和低濃度鎢酸鋰組，且出現(xiàn)三級和多級神經(jīng)元；高濃度鎢酸鋰組，存活的神經(jīng)元較多，以三級和多級神經(jīng)元為主，突起較長，生長速度較快，進而局部形成網(wǎng)絡(luò)。見圖2。圖2  倒置顯微鏡（×250）下觀察各組小鼠培養(yǎng)48 h的大

12、腦皮層神經(jīng)元生長情況（略）3  討論    目前認(rèn)為A在AD病理機制中扮演著非常重要的角色。因此阻止A的合成和沉積，促進其代謝的藥物在AD治療中具有很大的潛力5。A抑制劑有抑制A生成和抑制A聚集兩大類6。細(xì)胞凋亡的異常也是AD腦的主要表現(xiàn)，同時，也是引起神經(jīng)元丟失的主要原因7。    本實驗所采用細(xì)胞株M146L是同時轉(zhuǎn)染了人類AD兩個相關(guān)基因（APP和突變型PS1）的CHO細(xì)胞，它能過度產(chǎn)生A142，是一較理想的探討A表達機制的細(xì)胞模型。    鋰為人體非必需微量元素，具有廣泛調(diào)節(jié)生理功能的作用，涉及神經(jīng)精神、免疫、內(nèi)分泌、血液等系統(tǒng)8。研究發(fā)現(xiàn)，鋰鹽可抑制tau蛋白磷酸化穩(wěn)定微管系統(tǒng)穩(wěn)定catenin以及抗細(xì)胞凋亡9，并可促進體外培養(yǎng)的神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖，拮抗谷氨酸鹽、糖皮質(zhì)激素等的抑制增殖作用。另有實驗發(fā)現(xiàn)，氯化鋰可明顯促進成年小鼠海馬齒狀回的細(xì)胞增殖與神經(jīng)元發(fā)生，而且新生的神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞比例基本不變。這一結(jié)果說明，氯化鋰的作用是多方面的，它不僅能增加新生神經(jīng)元，而且還能促進神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，鎢酸鈉與氯化鋰一樣，都是GSK3抑制劑，并且和氯化鋰合用具有協(xié)同作用。