實驗十三 細(xì)菌的生理生化反應(yīng) - 成都大學(xué)

1、實驗十三 細(xì)菌的生理生化反應(yīng)甲基紅試驗、糖發(fā)酵試驗、淀粉水解試驗，H2S試驗，一、實驗?zāi)康?了解細(xì)菌鑒定中常用的主要生理生化反應(yīng)試驗法及其原理。2比較4種菌的大分子水解實驗結(jié)果。3比較4種菌的甲基紅反應(yīng)結(jié)果。4學(xué)習(xí)如何使用杜氏小管進(jìn)行糖發(fā)酵試驗，并比較3種菌的糖發(fā)酵試驗結(jié)果。二、實驗原理各種細(xì)菌由于具有不同的酶系統(tǒng)，致使它們能利用不同的底物，或雖然可以利用相同的底物，卻產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，因此可以利用各種生理生化反應(yīng)來鑒別細(xì)菌。糖發(fā)酵是最常用的生化反應(yīng)，存在于大多數(shù)細(xì)菌中。不同的細(xì)菌在糖的分解能力上存在很大的差異。有些細(xì)菌能分解某種糖并產(chǎn)生酸性物質(zhì)(如乳酸、丙酸、醋酸等)和氣體(如二氧化碳、氫

2、、甲烷等)，而有些細(xì)菌只產(chǎn)生酸不產(chǎn)生氣體。例如大腸桿菌分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但不能分解乳糖。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來判斷。在培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫(pH52為黃色，pH68為紫色)，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵試管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡的出現(xiàn)來驗證。三、實驗器材大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌的斜面菌種。熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureuse），2葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖、乳糖或蔗糖)；淀粉培養(yǎng)

3、基、硫化氫實驗培養(yǎng)基、石蕊牛乳培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基。40NaOH溶液、甲基紅試劑、1.6溴甲酚紫指示劑。3超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、試管、移液管，杜氏小管。四、實驗方法（一）甲基紅試驗：1試管標(biāo)記  取5支裝有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌，枯草芽孢桿菌和空白對照。2接種培養(yǎng)  以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對照不接菌。置37恒溫箱中，培養(yǎng)2448h。3觀察記錄取出以上試管，振蕩2min。另取5支空試管相應(yīng)標(biāo)記菌名，分別加入35mL以上對應(yīng)管中的培養(yǎng)液，各加入23滴甲基紅指示劑，注意沿管壁加入，仔細(xì)觀察培養(yǎng)

4、液上層，若培養(yǎng)液上層變成紅色，即為陽性反應(yīng)，若仍呈黃色，則為陰性反應(yīng)，分別用“+”或“一”表示。（二）糖發(fā)酵試驗：1試管標(biāo)記2接種培養(yǎng)3觀察記錄  與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“-”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié)果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“+”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“”示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“”表示。（三）淀粉水解試驗 （一）淀粉水解試驗?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，再被細(xì)菌吸收利用。淀粉水解后遇碘不再變

5、藍(lán)色。試驗時將裝有淀粉培養(yǎng)基的三角瓶置于洗水浴中融化，然后取出冷卻至約50左右，即傾入培養(yǎng)皿中，待凝固后制成平板。每個同學(xué)用接種環(huán)取少量菌涂在平板上，每個菌種涂片 0.30.5cm大小的圓（見圖14-1）、其中一種應(yīng)以枯草桿菌（Bacillus subtilis）作為對照菌。圖141 淀粉水解試驗接種示意圖1. 枯草芽孢桿菌2. 試驗菌13. 大腸桿菌4. 試驗菌2將培養(yǎng)皿倒置于37恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察時打開皿蓋滴加少量碘液于平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌體周圍出現(xiàn)無色透明圈，則說明淀粉已被水解。透明圈的大小，說明該菌水解淀粉能力的強弱。（四）硫化氫的產(chǎn)生試驗許多細(xì)菌能從培

6、養(yǎng)基中的含硫有機化合物產(chǎn)生硫化氫。硫化氫遇鉛鹽（或鐵鹽）則形成黑色硫化鉛（或黑色硫化鐵）。試驗常用胱氨酸或半胱氨酸作為含硫有機物。1方法接種與觀察：用新鮮斜面培養(yǎng)物（菌種）接種到硫化氫試驗培養(yǎng)基中。接種后，用無菌鑷子夾取醋酸鉛濾紙條用棉塞塞緊，使懸掛于管中，下端接進(jìn)培養(yǎng)基表面，不接觸液面，適溫培養(yǎng)。于接種后3、7、14天觀察，紙條變黑者為陽性，不變者為陰性。2. 注意事項a. 此方法比較敏感，本培養(yǎng)基不適用于腸桿菌科。b. 紙條高度應(yīng)放置適當(dāng)，離液面太遠(yuǎn)影響靈敏度，太近容易被濺濕。同時移動試管時也要平穩(wěn)。c. 除空白對照外，應(yīng)放陰性對照。（五）石蕊牛奶試驗牛乳中通常含有蔗糖、乳糖、蛋白質(zhì)、酪蛋

7、白等成分。細(xì)菌對牛乳的利用主要是指對乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。中性時石蕊呈淡紫色，酸性時呈紅色，堿性時呈藍(lán)色，還原時則部分或全部脫色。細(xì)菌對牛乳的利用可分三種情況：1. 酸凝固作用細(xì)菌發(fā)酵乳糖后，產(chǎn)生許多酸，使石蕊牛乳變紅，當(dāng)酸度很高時，可使牛乳凝固，此稱為酸凝固。2. 凝乳酸凝固作用某些細(xì)菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，這種凝固在中性環(huán)境中發(fā)生。通常這種細(xì)菌還具有水解蛋白質(zhì)的能力，因而產(chǎn)生一些堿性物質(zhì)，使石蕊變藍(lán)。3. 胨化作用酪蛋白被水解，使牛乳變成清亮透明的液體。胨化作用可以在酸性條件下或堿性條件下進(jìn)行，一般石蕊色素被還原脫色。接種大

8、腸桿菌或熒光假單胞菌于石蕊牛乳培養(yǎng)基中，置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)7d。另外保留1支不接種的石蕊牛乳培養(yǎng)基作為對照。（六）油脂水解試驗?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生脂肪酶（胞外酶），能分解培養(yǎng)基中的脂肪成為甘油及脂肪酸。試驗時，將裝有油脂培養(yǎng)基的錐形瓶置于沸水浴中融化，取出并充分振蕩使油脂均勻分布，再傾入培養(yǎng)皿中，待凝固后，做成平板。每個同學(xué)劃線接種于同一平板的兩邊，其中一種是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為對照菌（圖9-2）。置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，取出后觀察平板底層長菌的地方，如出現(xiàn)紅色斑點，即說明脂肪被水解，此反應(yīng)為正反應(yīng)。圖14-2 油脂水解試驗接種示意圖1. 金黃色葡

9、萄球菌2. 大腸桿菌3. 試驗菌14. 試驗菌2五、實驗報告細(xì)菌生理生化反應(yīng)試驗測定結(jié)果：六、關(guān)鍵步驟與注意事項1甲基紅試驗中，不要過多滴加甲基紅指示劑，以免出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。2在糖發(fā)酵試驗的培養(yǎng)管中裝入倒置杜氏小管時，注意防止小管內(nèi)有殘留氣泡。滅菌時適當(dāng)延長煮沸時間可除去管內(nèi)氣泡。七、思考題 1細(xì)菌生理生化反應(yīng)試驗中為什么要設(shè)有空白對照?2哪些生理生化試驗可用于區(qū)別大腸桿菌和產(chǎn)生腸桿菌?結(jié)果如何?3甲基紅試驗和伏一普試驗的最終產(chǎn)物如何?為什么會出現(xiàn)不同的最終產(chǎn)物?4現(xiàn)分離到一株腸道細(xì)菌，試結(jié)合本實驗學(xué)到的知識設(shè)計一個試驗方案進(jìn)行鑒別。5分述淀粉水解試驗油脂水解試驗和石蕊牛奶試驗的基本生化原理。

10、附培養(yǎng)基： 1淀粉水解培養(yǎng)基蛋白胨 10g氯化鈉 5g可溶性淀粉 2g，牛肉膏 3g，瓊脂 1520g，水 1000mL，pH 7.47.8，121高壓蒸汽滅菌30min。2硫化氫試驗培養(yǎng)基蛋白胨 10g，胱氨酸 0.1g，Na2SO4 0.1g，蒸餾水1000mL，pH7.07.4分裝試管。每管液層高度45cm。0.6kg蒸汽滅菌2030min。另外將普通濾紙剪成0.51cm寬的紙條。長度根據(jù)試管與培養(yǎng)基高度而定。用5-10的醋酸鉛將紙條浸透，然后用烘箱烘干，放于培養(yǎng)皿內(nèi)滅菌備用。3石蕊牛奶培養(yǎng)基（1）脫脂牛奶的制備新鮮牛奶用離心機分離，除去上層奶油，取下層脫脂牛奶。若無新鮮牛奶可用脫脂奶粉代替，每1000mL溶解100g脫脂奶粉，或?qū)Ⅴr奶煮沸，在冷涼處靜（2）石蕊液的的制備將石蕊浸色即在蒸餾水中過夜或更長時間，使石蕊變軟而易于溶解，溶解后過濾，即可用作配制石蕊牛奶。石蕊2.9g，蒸餾水100mL（3）石蕊牛奶的配制：2.5石蕊水溶液4mL，脂肪牛奶100mL，混合后的顏色為丁香花紫色為適度，分裝試管，牛奶高度約4cm。間歇滅菌或以0.6kg蒸氣滅菌20-30min。注意事項：最好用新鮮牛奶，否則需調(diào)pH，但調(diào)過pH的牛奶色調(diào)不正。4. 油脂