基于青天葵組培物超低溫保存問題

1、基于青天葵組培物超低溫保存問題    【摘要】  目的用超低溫方法保存青天葵組培物。方法采用單因子比較法、均勻設(shè)計法考察生長周齡、冷凍保護(hù)劑、預(yù)培養(yǎng)時間、降溫方式、化凍方式等因素對青天葵組培物超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響。結(jié)果青天葵組培物較佳的超低溫保存程序為： 周齡的組培物，在 進(jìn)行低溫鍛煉 ，以   為冷凍保護(hù)劑，在靜置處理 ，然后在，停留  后投入液氮中保存，材料取出后，在化凍，無菌洗滌后，再接種，組培物能夠存活并繼續(xù)生長。結(jié)論超低溫保存方

2、式可以成功保存青天葵組培物種質(zhì)資源。 【關(guān)鍵詞】  青天葵 組培物 超低溫保存Abstract：Objective  the    Nervilia fordii   Methods    （ ）       .Results        

3、0;                                ，      ，      （ ）    

4、             l Conclusion   Nervil ia fordii       Key words：Nervilia fordii；   ；   前言   青天葵別名獨(dú)葉蓮、青蓮、天葵、芋蘭等，來源于蘭科多年

5、生宿根草本植物毛唇芋蘭Nervilia fordii （） ，以葉或帶塊莖的葉入藥，有清肺止咳、健脾消積、鎮(zhèn)靜止痛、清熱解毒、散結(jié)消疬之功效，主治肺癆、咳嗽咳血、瘰疬、腫毒、跌打損傷、小兒疳積、精神病、口腔炎、急性咽喉炎等，對小兒肺炎有特效。    由于青天葵種子無胚乳，僅靠無性繁殖，自然繁殖數(shù)量少，繁殖系數(shù)極低，資源分布極其有限。多年來，因亂采亂挖，多是連葉帶塊莖采挖加工，導(dǎo)致野生青天葵資源日益枯竭。    我們已經(jīng)開展青天葵組織培養(yǎng)及植株再生的研究工作 ，本研究青天葵組培

6、物超低溫保存的影響因素，為青天葵資源再生和種質(zhì)保存提供技術(shù)資料和理論依據(jù)。  材料與方法  材料本實(shí)驗所用青天葵組培物是由青天葵球莖誘導(dǎo)產(chǎn)生的根狀莖。在含有  ·  的 培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度（ ±），每天光照 ，光照強(qiáng)度 。經(jīng)不同周齡對比試驗后，采用 周齡的組培物作為超低溫保存的試驗材料。  方法  冷凍保護(hù)劑考察，（甘油），（聚乙二醇），（蔗糖），（葡萄糖），（水解酪蛋白） 種冷凍保護(hù)

7、劑及其不同濃度配比的冷凍保護(hù)效果。  預(yù)培養(yǎng)將組培物轉(zhuǎn)至含（二甲基亞砜）的培養(yǎng)基上，置于進(jìn)行零上低溫鍛煉?？疾煸诖藯l件下預(yù)培養(yǎng)時間對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響。  冷凍程序?qū)⒔M培物放入  聚乙烯塑料冷凍管中，加入預(yù)冷的保護(hù)劑，使之淹沒組培物，旋緊管塞，在 靜置處理 。然后將冷凍管放入，停留一定時間后投入液氮中保存?？疾煸?#160;溫度下停留不同時間（， ），對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響。   化凍與洗滌材料從液氮中取出化凍?？疾觳煌幕瘍龇绞剑毫闵系蜏?，的化凍效果。&#

8、160;   待冷凍管中的冰融化后，立即加入 培養(yǎng)液（大量元素蔗糖），輕輕振搖，停留 ，傾出溶液，如此反復(fù)洗滌次。  細(xì)胞生活力的檢測按簡令成報道的方法：稱取洗滌后的組培物 ，加入 氯化三苯四氮唑（）液，在黑暗條件下靜置染色 。吸去 液，用蒸餾水洗滌 次。加入丙醇研磨提取 被脫氫酶還原后生成的紅色甲。用 型分光光度計，在  處測試丙醇提取液的吸收值。用這個吸收值（）值表示各處理的愈傷組織經(jīng)超低溫保存后的細(xì)胞生活力。  

9、;結(jié)果分析  組培物生長周齡對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響細(xì)胞抗凍能力的提高與其分裂和生長活動等生理狀態(tài)密切相關(guān)。取轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上的組培物，考察不同的生長周齡（， 周）對組培物經(jīng)超低溫保存后的細(xì)胞生活力。結(jié)果見圖。圖1  組培物生長周齡對冷凍后細(xì)胞生活力的影響 （略）圖2  預(yù)培養(yǎng)時間對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響（略）    由圖 知，將組培物轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基上，開始 周，冷凍后細(xì)胞的 值較低，說明細(xì)胞的抗凍能力弱，培養(yǎng)至第 周時， 值迅速升高，細(xì)胞抗凍能力顯著增強(qiáng)，第 周的 值最高，此時細(xì)胞的抗凍能力最強(qiáng)，此后，隨著培養(yǎng)周齡的增加，值呈下降趨勢，細(xì)胞抗凍能力逐漸減弱。因此選擇 周齡的組培物作為超低溫保存的材料是適宜的。  冷凍保護(hù)劑對超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響結(jié)果見表。表1  U12（12）12均勻設(shè)計因子水平（略