RT-PCR操作流程及其相關注意事項

1、一、知識背景：1、基因表達：DNA RNA Protein2、PCR技術(Polymerase chain reaction)：即聚合酶鏈式反應。在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應，其特異性由兩個人工合成的引物序列決定。反應分三步：A、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；B、退火：將反應混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在下，退火引物沿5 3方向延伸。以上三步為一個循環(huán)，如此反復。3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴R

2、NA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；2、Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA；3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA.4、引物的設計及其原則：引物的特異性決定PCR反應特異性。盡量選擇覆蓋相連兩個內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。a、引物長度:一般為1530bp ，引物太短會影響PCR的特異性，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應的特異性。b、堿基分布：四種堿基最好應隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的

3、聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：4060，PCR擴增的復性溫度一般是較低Tm值減去510度。c、 3端要求：3端必須與模板嚴格互補，不能進行任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時錯配的引發(fā)效率最低，G、C居中間，因此引物的3端最好選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個以上的T。d、引物自身二級結(jié)構(gòu)：引物自身不應存在互補序列，否則會自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復性。e、引物之間的二級結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應有多于4個連續(xù)堿基互補，3端不應超過2個。f、同源序列：引物與非特異擴增序列的同源性應小于連續(xù)8個的互補堿基存在。g、5端無嚴格限制：5末端堿基

4、可以游離，但最好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進行特異修飾（標記、酶切位點等）等等。根據(jù)實驗目的選擇適當?shù)囊?。常用引物設計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設置。RNA提取（用Trizol法提?。┳⒁馐马棧?、整個操作過程中總是帶著帽子、口罩和手套2、整個RT-PCR過程均必須使用無菌無RNA酶的制品（玻璃物品和飯盒需在180烤箱烘烤10h，注意烘烤時最好是早上開180烤箱，晚上到時間后一定要關掉，第二天早上將所需物品取出。取東西時需帶好帽子和口罩，輕柔操作，防止有空氣逆流入烤箱引起RNA酶污染；塑料制品泡1DEPC水72h,DEPC水提前一天配

5、制，并用玻璃棒攪拌混勻。連續(xù)高溫高壓消毒3次，以充分降解DEPC。）3、除非特別注明，所有程序均在室溫（1530）下進行，試劑也放置于室溫。4、提RNA前，收拾干凈試驗臺，盡量不要放無關的物品；將試驗臺桌面用普通的75%酒精仔細擦兩遍；將所需用到的移液器全部用普通的75%酒精仔細擦拭干凈。需要的試劑：氯仿、異丙醇（裝此試劑的廣口瓶，瓶蓋最好用錫箔紙包一下）75%乙醇（溶于DEPC處理的水中）DEPC-treated water：100ul DEPC +100 ml ddH2O制成1DEPC水，放入RNase-free的玻璃瓶中用RNase-free的玻璃棒攪拌，靜置12小時以上，高溫高壓消毒。

6、RNase-free H2O的制備：把水加入到RNase-free的玻璃瓶中，加入DEPC至0.01%（v/v）,靜置過夜，高壓蒸汽滅菌，連續(xù)3遍。需要的器具：100ml棕色廣口瓶2個、100ml白色廣口瓶4個、鉗子2把、飯盒一個、100ml量筒一個、藍、黃、白Tip頭若干、1.5EP管、0.5EP管、PCR管若干、PE手套、錫箔紙若干、4離心機需提前降溫、1200ul、1000ul、400ul平衡管，大培養(yǎng)皿一套，濾紙、滴管3支，比色皿1個操作步驟：1、 均質(zhì)化：單層培養(yǎng)的細胞，直接在培養(yǎng)瓶中裂解。倒掉培基，中號培養(yǎng)瓶中直接加入1mlTrizol試劑，加入后即反復抽吸、吹打細胞數(shù)次（約204

7、0次）室溫(1530)孵育5min（以利于勻漿樣品中核蛋白體完全解離）轉(zhuǎn)移均質(zhì)溶液到新的1.5mlEP管中2、 相分離：每1mlTrizol試劑加入200ul氯仿，小心蓋緊管蓋（單手操作；將裝氯仿和異丙醇的廣口瓶放在正前方遠離自己的位置，操作時不會越過瓶口上方造成污染；取氯仿時，不要把瓶蓋放在桌面上，取完立即蓋好瓶蓋）用手劇烈震蕩15s室溫(1530)靜置23min（215min）4 12000g 離心15min(將EP管在離心機取出時需十分小心，盡量不要使EP管晃動)RNA存在于水相中，水相體積約為60%均質(zhì)化時使用的Trizol試劑量水相（無色）中間相，白色紅色下層（酚、氯仿相）3、 RN

8、A沉淀水相轉(zhuǎn)移至一個新的1.5mlEP管【注意：EP管垂直；槍垂直、貼壁、用200ul槍緩慢抽；一共最多抽400ul，寧缺勿濫】混合異丙醇，以從水相中沉淀RNA，每1ml用于初始同質(zhì)化的Trizol試劑，使用500ul異丙醇，輕輕顛倒混勻12次室溫(1530)孵育樣品10min(510min)【將逆轉(zhuǎn)錄的試劑置于冰上溶解備用】4 12000g 離心10min(往往離心前RNA沉淀不可見，離心后在管側(cè)面和底部形成一個凝膠樣沉淀)4、 RNA洗滌棄上清（緩慢倒出）用75%乙醇洗滌RNA沉淀一次每ml用于初始同質(zhì)化的Trizol試劑使用至少1ml75%乙醇（可用75%乙醇預洗一次放進去乙醇，不漩渦，

9、小心倒掉；再加入1ml乙醇） 漩渦混合4 7500g離心5min緩慢倒出上清液，再用小離心機離心數(shù)秒，用20ul的槍移走剩余的水，以保證整個EP管的干燥是同步的。整個過程一定要小心。5、 重新溶解RNA簡單干燥RNA沉淀空氣干燥510min【將有RNA沉淀的EP管放入裝有濾紙的大培養(yǎng)皿中；不要讓RNA沉淀完全干燥，這將大大降低其溶解度】用無RNAse free water（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒里的一般用不完） 20ul吹打幾次，溶解RNA用紫外分光光度計測定A260/A280及RNA的濃度1.82.0比較好注：紫外分光光度計的使用：打開后面的電源按RNA確定RNA對應的設置時1OD=40 向比色皿中加

10、入50ul高溫消毒之后的三蒸水blank將其中的水吸出加入3ulRNA+47ul三蒸水漩渦混勻后的樣品dilutionentersample（默認光程為10mm，比色皿光面對著自己）逆轉(zhuǎn)錄（應用GeneCopoeiaTM First Strand cDNA Synthesis Kit）：1、準備：緩慢顛倒混勻試劑，避免起泡，并經(jīng)瞬時離心后，放置冰上待用。 用于制備RNA-Primer Mix的EP管需在冰上預冷。2、制備RNA-Primer Mix,輕彈幾下混勻，瞬時離心 試劑組分體積終含量total RNA2ug60M Oligo(dT)181 l2.4 MddH2O (DNase/RNas

11、e Free)To 13ulX3、變性RNA65加熱RNA-Primer Mix，10min（RNA二級結(jié)構(gòu)打開，增加反應產(chǎn)量）立即放置冰上冷卻（消除RNA大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合）、4、配制逆轉(zhuǎn)錄反應液：在已冷卻的RNA-Primer Mix反應管內(nèi)加入以下試劑至總體積25 l。試劑組分 體積 終濃度RNA-Primer Mix 13 l5×RT Reaction Buffer 5 l 1×25 mM dNTP 1 l 1 mM25 U/l RNase Inhibitor 1 l 1 U/ul200U/ul M-MLV RTase (RNase H-) 1 l

12、8U/ulddH2O (DNase/RNase Free) 4 l總體積 25ul5、逆轉(zhuǎn)錄反應混勻反應Mix，瞬時離心，42 60min6、 滅活并保存逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加熱至85 5min,終止反應在PCR儀上設置4 hold將cDNA保存于-20PCR階段：反應體系50L= PCR-Mix+模板+引物1+引物2+去RNA酶的水反應條件：95預變性5min后，94變性30s，55退火40s，72延伸1min；共進行35個循環(huán)后72延伸10min。取10L產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳、照相。并采用凝膠圖像處理軟件ImageTool（IT）3.0測量灰度值，計算mRNA表達的相對值。計算方法：mRNA表

13、達的相對值目的基因灰度值-actin灰度值。凝膠電泳：1、先高火煮瓊脂糖，見快要冒泡時即轉(zhuǎn)到低火，直至溶液清亮為止。開始可能會冒泡比較多，不要讓其溢出來，之后就不會冒出來了。2、灌膠時，先緩慢灌膠再插梳齒，不容易出氣泡。3、電泳緩沖液最好每次都用新的；至少要保證電泳緩沖液中不能有很多氣泡。3、膠跑到中間時，可以放到機子上去顯影，看有無目的條帶，是否需要繼續(xù)跑。trizol試劑盒提取總RNA。取2g總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄后各取7.5L行PCR反應，-actin為內(nèi)參照。TRX引物：上游為5'-CATATGGTGAAGCAGATCGAGAG-3，下游為5- TGTCACGCAG A T G G

14、CAACTG -3，擴增片段大小為420bp。-actin引物：上游為5'-CCTTCCTG GGCATGGAGTCCT-3'，下游為5'- GGAGCAATGATCTT GATCT T-3'，擴增片段大小為204bp。4、分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度（）線性DNA片段的有效分離范圍（kb）0.51300.70.8121.00.5101.20.471.50.235、電泳緩沖液配方：TAE（Tris-乙酸） 工作液 貯存液/1000ml (1×) (50×) 40mmol/L Tris-乙酸 242g Tris-base 1mmol/ L EDTA 57.1ml 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA(PH=8.0)TBE (Tri