綠色熒光蛋白和PCR技術(shù)

1、綠色螢光蛋白(green fluorescent protein)，簡(jiǎn)稱GFP，這種蛋白質(zhì)最早是由下村修等人在1962年在一種學(xué)名Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)。其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色螢光。這個(gè)發(fā)光的過(guò)程中還需要冷光蛋白質(zhì)Aequorin的幫助，且這個(gè)冷光蛋白質(zhì)與鈣離子(Ca2+)可產(chǎn)生交互作用。由水母Aequorea victoria中發(fā)現(xiàn)的野生型綠色螢光蛋白，395nm和475nm分別是最大和次大的激發(fā)波長(zhǎng)，它的發(fā)射波長(zhǎng)的峰點(diǎn)是在509nm，在可見(jiàn)光綠光的范圍下是較弱的位置。由海腎(sea pansy)所得的綠色螢光蛋白，僅有在498n

2、m有一個(gè)較高的激發(fā)峰點(diǎn)。在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域中，綠色螢光蛋白基因常被用作為一個(gè)報(bào)導(dǎo)基因(reporter gene)。一些經(jīng)修飾過(guò)的型式可作為生物探針，綠色螢光蛋白基因也可以克隆到脊椎動(dòng)物(例如:兔子上進(jìn)行表現(xiàn)，并拿來(lái)映證某種假設(shè)的實(shí)驗(yàn)方法。2008年10月8日，日本科學(xué)家下村修（伍茲霍爾海洋生物學(xué)研究所）、美國(guó)科學(xué)家馬丁·查爾菲（哥倫比亞大學(xué)）和錢永健（加利福尼亞大學(xué)圣迭戈分校）因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)和改造綠色熒光蛋白而獲得了當(dāng)年（2008）的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 GFP的性質(zhì) GFP熒光極其穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescei

3、n)強(qiáng)，特別在450490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定。GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问剑坏┲匦卤┞对诳諝饣蜓鯕庵?，GFP熒光便立即得到恢復(fù)。而一些弱還原劑并不影響GFP熒光。中度氧化劑對(duì)GFP熒光影響也不大,如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等。GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強(qiáng),因此更適用于定量測(cè)定與分析。但因?yàn)镚FP不是酶，熒光信號(hào)沒(méi)有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白。由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能，熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白，其作用是任何其它酶類報(bào)

4、告蛋白無(wú)法比擬的。 GFP在腫瘤發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用GFP是一個(gè)分子量較小的蛋白，易與其他一些目的基因形成融合蛋白且不影響自身的目的基因產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能。GFP 與目的基因融合，將目的基因標(biāo)記為綠色，即可定量分析目的基因的表達(dá)水平，顯示其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置和量的變化，為探討該基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制提供便利條件。在腫瘤的形成過(guò)程中，增殖和凋亡是一對(duì)相互矛盾的統(tǒng)一體。若腫瘤細(xì)胞凋亡占優(yōu)勢(shì)，腫瘤組織將長(zhǎng)期處于休眠狀態(tài)或自行消亡。腫瘤細(xì)胞的凋亡受凋亡相關(guān)基因調(diào)控。用GFP轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，并與正常組織進(jìn)行比較，則大致可判斷此基因?yàn)橐种颇[瘤細(xì)胞凋亡的基因；反之，為促進(jìn)腫

5、瘤細(xì)胞凋亡的基因。腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)是腫瘤細(xì)胞粘連、酶降解、移動(dòng)和基質(zhì)內(nèi)增殖等一系列過(guò)程的表現(xiàn)，其根本原因在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些基因表達(dá)異常。利用GFP 的示蹤特性，研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些基因異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系，即可揭示腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的某些機(jī)制。 發(fā)現(xiàn)過(guò)程1994年，華裔美國(guó)科學(xué)家錢永?。≧oger Y Tsien）開始改造GFP，有多項(xiàng)發(fā)現(xiàn)。世界上用的大多數(shù)是錢永健實(shí)驗(yàn)室改造后的變種，有的熒光更強(qiáng)，有的黃色、藍(lán)色，有的可激活、可變色。到一些不常用做研究模式的生物體內(nèi)找有顏色的蛋白成為一些人的愛(ài)好，現(xiàn)象正如當(dāng)年在嗜熱生物中找到以后應(yīng)用廣泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮。不過(guò)真發(fā)現(xiàn)的有用東西并不很多。成

6、功的例子有俄國(guó)科學(xué)院生物有機(jī)化學(xué)研究所Sergey A. Lukyanov實(shí)驗(yàn)室從珊瑚里發(fā)現(xiàn)其他熒光蛋白，包括紅色熒光蛋白。生物發(fā)光現(xiàn)象，下村修和約翰森以前就有人研究。螢火蟲發(fā)熒光，是由熒光酶（luciferase）作為酶催化底物分子熒光素（luciferin），有化學(xué)反應(yīng)如氧化，以后產(chǎn)生熒光。而蛋白質(zhì)本身發(fā)光，無(wú)需底物，起源是下村修和約翰森的研究。下村修和約翰森用過(guò)幾種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，和本故事相關(guān)的是學(xué)名為Aequorea victoria的水母。1962年，下村修和約翰森等在細(xì)胞和比較生理學(xué)雜志上報(bào)道，他們分離純化了水母中發(fā)光蛋白水母素。據(jù)說(shuō)下村修用水母提取發(fā)光蛋白時(shí)，有天下班要回家了，他把產(chǎn)物

7、倒進(jìn)水池里，臨出門前關(guān)燈后，依依不舍地回頭看了一眼水池，結(jié)果見(jiàn)水池閃閃發(fā)光。因?yàn)樗匾步邮莛B(yǎng)魚缸的水，他懷疑是魚缸成分影響水母素，不久他就確定鈣離子增強(qiáng)水母素發(fā)光。1963年，他們?cè)诳茖W(xué)雜志報(bào)道鈣和水母素發(fā)光的關(guān)系。其后Ridgway和Ashley 提出可以用水母素來(lái)檢測(cè)鈣濃度，創(chuàng)造了檢測(cè)鈣的新方法。鈣離子是生物體內(nèi)的重要信號(hào)分子，水母素成為第一個(gè)有空間分辨能力的鈣檢測(cè)方法，是目前仍用的方法之一。1955年Davenport和Nicol發(fā)現(xiàn)水母可以發(fā)綠光，但不知其因。在1962 年下村修和約翰森在那篇純化水母素的文章中，有個(gè)注腳，說(shuō)還發(fā)現(xiàn)了另一種蛋白，它在陽(yáng)光下呈綠色、鎢絲下呈黃色、紫外光下發(fā)

8、強(qiáng)烈綠色。其后他們仔細(xì)研究了其發(fā)光特性。1974年，他們純化到了這個(gè)蛋白，當(dāng)時(shí)稱綠色蛋白、以后稱綠色熒光蛋白GFP。Morin和Hastings提出水母素和GFP之間可以發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。水母素在鈣刺激下發(fā)光，其能量可轉(zhuǎn)移到GFP，刺激GFP發(fā)光。這是物理化學(xué)中知道的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)在生物中的發(fā)現(xiàn)。下村修本人對(duì)GFP的應(yīng)用前景不感興趣，也沒(méi)有意識(shí)到應(yīng)用的重要性。他離開普林斯頓到 Woods Hole海洋研究所后，同事普臘石(Douglas Prasher)非常感興趣發(fā)明生物示蹤分子。1985年普臘石和日裔科學(xué)家Satoshi Inouye獨(dú)立根據(jù)蛋白質(zhì)順序拿到了水母素的基因（準(zhǔn)確地說(shuō)是

9、cDNA）。1992年，普臘石拿到了GFP的基因。有了cDNA，一般生物學(xué)研究者就很好應(yīng)用，比用蛋白質(zhì)方便多了。普臘石1992年發(fā)表GFP的cDNA后，不做科學(xué)研究了。他申請(qǐng)美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金時(shí)，評(píng)審者說(shuō)沒(méi)有蛋白質(zhì)發(fā)光的先例，就是他找到了，也沒(méi)什么價(jià)值。一氣之下，他離開學(xué)術(shù)界去麻省空軍國(guó)民衛(wèi)隊(duì)基地，給農(nóng)業(yè)部動(dòng)植物服務(wù)部工作。當(dāng)時(shí)他如果花幾美元，就可以做一個(gè)一般研究生都能做，但是非常漂亮的工作：將水母的GFP基因放到其他生物體內(nèi)，比如細(xì)菌里，看到熒光，就完全證明GFP本身可以發(fā)光，無(wú)需其它底物或者輔助分子。將GFP表達(dá)到其它生物體這項(xiàng)工作，1994年由兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立進(jìn)行：美國(guó)哥倫比亞大學(xué)做線蟲的M

10、arty Chalfie實(shí)驗(yàn)室，和加州大學(xué)圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的兩位日裔科學(xué)家Inouye和Tsuji。水母素和GFP都有重要的應(yīng)用。但水母素仍是熒光酶的一種，它需要熒光素。而GFP蛋白質(zhì)本身發(fā)光，在原理上有重大突破。Chalfie的文章立即引起轟動(dòng)，很多生物學(xué)研究者紛紛將GFP引入自己的系統(tǒng)。在一個(gè)新系統(tǒng)表達(dá)GFP就能在自然、科學(xué)上發(fā)表文章，其實(shí)不過(guò)是跟風(fēng)性質(zhì)，沒(méi)有原創(chuàng)性?？v觀整個(gè)過(guò)程，從1961年到1974年，下村修和約翰森的研究遙遙領(lǐng)先，而很少人注意。如果其他生化學(xué)家愿意，他們也可以得到水母素和GFP，技術(shù)并不特別難。在1974年以后，特別是八十年代后，后繼的工作，很多研

11、究生都很容易做。其中例外是錢永健實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)變種出現(xiàn)新顏色，并非顯而易見(jiàn)。 綠色熒光蛋白的應(yīng)用1、骨架和細(xì)胞分裂 Kevin Sullivan's 實(shí)驗(yàn)室 酵母菌內(nèi)SPB 和微管動(dòng)力學(xué) 酵母菌中肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力果蠅中MEI-S332蛋白果蠅有絲分裂和mRNA運(yùn)輸網(wǎng)丙菌屬細(xì)胞骨架 RNA剪切因子的核內(nèi)運(yùn)輸網(wǎng)丙菌屬的趨化作用網(wǎng)丙菌屬中細(xì)胞骨架動(dòng)力和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)核動(dòng)力網(wǎng)丙菌屬中細(xì)胞動(dòng)力細(xì)胞骨架動(dòng)力和胞內(nèi)運(yùn)輸 2、細(xì)胞器動(dòng)力學(xué)和泡囊運(yùn)輸用GFP顯示小囊運(yùn)輸用GFP觀察TGN運(yùn)輸細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和胞內(nèi)運(yùn)輸 3、發(fā)育生物學(xué)用GFP觀察線蟲的神經(jīng)發(fā)育分析果蠅神經(jīng)發(fā)育的不對(duì)稱性細(xì)胞分裂線蟲Lin-14Fisch

12、bach lab用GFP觀察網(wǎng)丙菌屬的形態(tài)發(fā)生學(xué)GFP在小鼠發(fā)育中的標(biāo)記方法 4、神經(jīng)生物學(xué)神經(jīng)極性發(fā)育 tracking intracellular transport of peptide neurotransmitters using GFP Allen LabEnhancer trapping using tau-GFP as reporter localized to axons5、其他應(yīng)用Cell surface organization in Natural Killer cells Dan Davislocalization of calmodulin in S. pombe

13、with GFPGFP-plakoglobin and expression plasmids Klymkowsky labMolecular Motion Laboratory Yale UniversityMeasuring diacylglycerol in vivo with a GFP-PKC chimera Tobias MeyerBentley Lab using GFP for on-line bioprocess monitoring & controlTracking viral proteins with GFP fusions6、GFP vectors and

14、technologyClontech Inc.Supplier of constructs for making GFP fusionsDeltaVision 3D microscopy platform optimized for imaging GFP in living cells in real timeGFP Expression Truly Amazing Web Site about GFP technologyUniversal Imaging Corp. makers of the MetaGFP image processing platformQuantum Biotec

15、hnologies IncSuppliers of GFP and BFP constructsGFP in ArabidopsisBabCo/Covance antibody to GFPLightools GFP plate illumination systemsGFP in Chlamydomonas 7、Other Interesting GFP LinksGFP Resources for TeachersPicture of Aequoria victoria, source of GFPStructure of green fluorescent proteinFull tex

16、t of Yang et al Nature Structural Bio paperTable of GFP mutant formsOptics in Cell Biology 來(lái)自海洋的禮物 綠色熒光蛋白在2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)上，綠色熒光蛋白成了主角。諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)將化學(xué)獎(jiǎng)授予美籍日裔科學(xué)家下村修、美國(guó)科學(xué)家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學(xué)家錢永健三人，以表彰他們發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)技術(shù)。在諾貝爾獎(jiǎng)新聞發(fā)布會(huì)的現(xiàn)場(chǎng)，發(fā)言人取出一支試管，置于藍(lán)光燈之下，只見(jiàn)這支試管中的物質(zhì)發(fā)出了綠色熒光什么是綠色熒光蛋白？綠色熒光蛋白分子的形狀呈圓柱形，就像一個(gè)桶，負(fù)責(zé)發(fā)光的基團(tuán)位于桶中央，

17、因此，綠色熒光蛋白可形象地比喻成一個(gè)裝有色素的“油漆桶”。裝在“桶”中的發(fā)光基團(tuán)對(duì)藍(lán)色光照特別敏感。當(dāng)它受到藍(lán)光照射時(shí)，會(huì)吸收藍(lán)光的部分能量，然后發(fā)射出綠色的熒光。利用這一性質(zhì)，生物學(xué)家們可以用綠色熒光蛋白來(lái)標(biāo)記幾乎任何生物分子或細(xì)胞，然后在藍(lán)光照射下進(jìn)行顯微鏡觀察。原本黑暗或透明的視場(chǎng)馬上變得星光點(diǎn)點(diǎn)那是被標(biāo)記了的活動(dòng)目標(biāo)。對(duì)生物活體樣本的實(shí)時(shí)觀察，在綠色熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用以前，是根本不可想象的。而這種徹底改變了生物學(xué)研究的蛋白質(zhì)，最初是從一種廣泛生活于太平洋海域的發(fā)光水母體內(nèi)分離得到的。在大自然中，具有發(fā)光能力的生物有不少，螢火蟲是陸地上最為我們所熟悉的發(fā)光生物，我國(guó)古代還有“捕螢數(shù)百入

18、囊內(nèi)照明夜讀”的佳話。在海洋里，某些水母、珊瑚和深海魚類也有發(fā)光的能力。特別是有的肉食性魚類專門靠一條閃著熒光的觸角來(lái)把其他小魚吸引到自己的嘴邊，海底總動(dòng)員里就有這種魚。事實(shí)上，大多數(shù)發(fā)光動(dòng)物能發(fā)光是靠?jī)煞N物質(zhì)熒光素和熒光素酶合作產(chǎn)生的結(jié)果。不同發(fā)光生物的熒光素和熒光素酶結(jié)構(gòu)是不一樣的。因此，這些生物的發(fā)光本領(lǐng)只能是它們自己的“專利”。20世紀(jì)60年代，一位日本科學(xué)家從美國(guó)西岸打撈了大量發(fā)光水母，帶回位于華盛頓州的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。這些水母在受到外界的驚擾時(shí)會(huì)發(fā)出綠色的熒光，這位科學(xué)家希望找到這種水母的熒光素酶。然而，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的重復(fù)努力，居然毫無(wú)收獲。他大膽地假設(shè)，這種學(xué)名叫Aequorea v

19、ictoria的水母能發(fā)光也許并不是常規(guī)的熒光素?zé)晒馑孛冈?。他想，可能存在有另一種能產(chǎn)生熒光的蛋白。此后，他進(jìn)行了更多的實(shí)驗(yàn)，終于搞清楚了這種水母的特殊發(fā)光原理。原來(lái)，在這種水母的體內(nèi)有一種叫水母素的物質(zhì)，在與鈣離子結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)出藍(lán)光，而這道藍(lán)光未經(jīng)人所見(jiàn)就已被一種蛋白質(zhì)吸收，改發(fā)綠色的熒光。這種捕獲藍(lán)光并發(fā)出綠光的蛋白質(zhì)，就是綠色熒光蛋白。這位日本科學(xué)家也因?yàn)檫@項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，獲得了剛剛頒發(fā)的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，他就是日本科學(xué)家下村修。綠色熒光蛋白有什么用呢？綠色熒光蛋的發(fā)光機(jī)理比熒光素?zé)晒馑孛敢?jiǎn)單得多。一種熒光素酶只能與相對(duì)應(yīng)的一種熒光素合作來(lái)發(fā)光，而綠色熒光蛋白并不需要與其他物質(zhì)合作，只需要用藍(lán)光照

20、射，就能自己發(fā)光。在生物學(xué)研究中，科學(xué)家們常常利用這種能自己發(fā)光的熒光分子來(lái)作為生物體的標(biāo)記。將這種熒光分子通過(guò)化學(xué)方法掛在其他不可見(jiàn)的分子上，原來(lái)不可見(jiàn)的部分就變得可見(jiàn)了。生物學(xué)家一直利用這種標(biāo)記方法，把原本透明的細(xì)胞或細(xì)胞器從黑暗的顯微鏡視場(chǎng)中“糾出來(lái)”。傳統(tǒng)的熒光分子在發(fā)光的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生具有毒性的氧自由基，導(dǎo)致被觀察的細(xì)胞死亡，這叫做“光毒性”，因此，在綠色熒光蛋白發(fā)現(xiàn)以前，科學(xué)家們只能通過(guò)熒光標(biāo)記來(lái)研究死亡細(xì)胞靜態(tài)結(jié)構(gòu)，而綠色熒光蛋白的光毒性非常弱，非常適合用于標(biāo)記活細(xì)胞。然而，綠色熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)20多年后，才有人將其應(yīng)用在生物樣品標(biāo)記上。1993年，馬丁·沙爾菲成功地通過(guò)基

21、因重組的方法使得除水母以外的其他生物(如大腸桿菌等)也能產(chǎn)生綠色熒光蛋白，這不僅證實(shí)了綠色熒光蛋白與活體生物的相容性，還建立了利用綠色熒光蛋白研究基因表達(dá)的基本方法，而許多現(xiàn)代重大疾病都與基因表達(dá)的異常有關(guān)。至此，生物醫(yī)學(xué)研究的一場(chǎng)“綠色革命”揭開了序幕。后來(lái)，美籍華人錢永健系統(tǒng)地研究了綠色熒光蛋白的工作原理，并對(duì)它進(jìn)行了大刀闊斧的化學(xué)改造，不但大大增強(qiáng)了它的發(fā)光效率，還發(fā)展出了紅色、藍(lán)色、黃色熒光蛋白，使得熒光蛋白真正成為了一個(gè)琳瑯滿目的工具箱，供生物學(xué)家們選用。目前生物實(shí)驗(yàn)室普遍使用的熒光蛋白，大部分是錢永健改造的變種。有了這些熒光蛋白，科學(xué)家們就好像在細(xì)胞內(nèi)裝上了“攝像頭”，得以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

22、各種病毒“為非作歹”的過(guò)程。通過(guò)沙爾菲的基因克隆思路，科學(xué)家們還培育出了熒光老鼠和熒光豬，由于沙爾菲與錢永健的突出貢獻(xiàn)，他們與綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)者下村修共享了今年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。瑞典皇家科學(xué)院將綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和改造與顯微鏡的發(fā)明相提并論，成為當(dāng)代生物科學(xué)研究中最重要的工具之一。PCR技術(shù)1.PCR技術(shù)基本原理 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下

23、輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基蚶齜糯蠹赴僂蟣丁醬鍥教?Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué) PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量

24、呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y(1X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩亍４蠖鄶?shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)是不可避免的。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5端之間，是需要擴(kuò)

25、增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3端開始延伸，其5端是固定的，3端則沒(méi)有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的5端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)， 這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)

26、物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。 2.PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系： 10×擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PC

27、R就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。 設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： 引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。 引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增

28、的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。 引物量： 每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。 酶及其濃度目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。 dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切

29、關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝， -20冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。 模板(靶基因)核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白

30、酶K來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 Mg2+濃度Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNT

31、P濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。 3.PCR反應(yīng)條件的選擇 PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。 溫度與時(shí)間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至40 60，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合

32、二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。 變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，9394lmin足以使模板DNA變性，若低于93則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。 退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其

33、濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T) 復(fù)性溫度=Tm值-(510) 在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性： 7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/S/酶分子 高于90時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。 PCR反應(yīng)的延

34、伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。34kb的靶序列需34min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 資料來(lái)源： 主題：PCR的基本原理 反應(yīng)條件選擇 推薦理由：1聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Re

35、action ,PCR)具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定 2，因?yàn)?中所述原因可以很好的研究致癌基因，而這正是我想涉足的領(lǐng)域。我愿意多了解一點(diǎn)這樣的知識(shí)，以便將來(lái)能夠用得上。RT-PCR技術(shù)RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用

36、途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無(wú)論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無(wú)RNA酶和基因組 DNA的污染。使用天為時(shí)代公司的總RNA提取系統(tǒng)（如目錄號(hào) DP405和DP406），所獲得的RNA的純度高，基因組DNA污染少，用于RT-PCR系統(tǒng)可得到滿意結(jié)果。 用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可。RT-PCR引物的選擇隨機(jī)引物：適用于長(zhǎng)的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA。適用

37、于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。 Oligo dT ：適用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要結(jié)合到PolyA 尾巴上，所以對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，即使有少量降解也 會(huì)使全長(zhǎng)cDNA合成量大大減少。 基因特異性引物： 與模板序列互補(bǔ)的引物，適用于目的序列已知的情況。天為時(shí) 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特別適合于與基因特異性 引物連用。 RT-PCR影響因素RT-PCR反應(yīng)受多個(gè)因素影響，如硫酸鎂的濃度, 引物退火的溫度，擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)等。 建議選擇0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸鎂作初步實(shí)驗(yàn)。 對(duì)于具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時(shí)的溫度對(duì)反應(yīng)有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。 大多數(shù)目標(biāo)RNA經(jīng)40輪PCR反應(yīng)就能觀察到。但如果目標(biāo)RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴(kuò)增的次數(shù)到45-50次。real time pcrReal time PCRReal time PCR(實(shí)時(shí)定量PCR) 定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析