腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在預(yù)缺血模型神經(jīng)保護中的作用

1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在預(yù)缺血模型神經(jīng)保護中的作用 10-10-29 13:43:00 作者：許靜，齊素華，張光毅編輯：studa20【摘要】 目的 研究腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在預(yù)缺血模型中的表達水平及作用，以探討缺血耐受形成的分子信號機制。方法 制備SD 大鼠大腦四動脈結(jié)扎模型及預(yù)缺血模型，采用免疫印跡、免疫沉淀等技術(shù)，檢測各實驗組中BDNF表達、其受體酪氨酸激酶受體B(TrkB)和下游蛋白胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化的水平變化。結(jié)果 預(yù)缺血組BDNF的表達、TrkB和ERK1/2磷酸化水平較缺血/再灌注組升高(P0.05)，而TrkB受體的拮抗劑K252a可以降低其升高的

2、激活水平(P0.05)。結(jié)論 預(yù)缺血激活BDNF-TrkB- ERK1/2信號通路實現(xiàn)其神經(jīng)保護作用。 【關(guān)鍵詞】 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;預(yù)缺血;缺血耐受Abstract: Objective To investigate the expression level and the role of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in ischemic preconditioning (IP) model and the underlying molecular signaling mechanism of ischemic tolerance.

3、Methods Ischemic preconditioning model was induced by the four-vessel occlusion in Sprague-Dawley rats. Immunoblotting and immunoprecipitation methods were employed to determine the variations in the expression level of BDNF, the phosphorylation levels of its receptor, tyrosine kinase receptor B (Tr

4、kB) and the downstream extracellular-signal-regulated kinase (ERK1/2). Results In the IP group, the levels of BDNF expression and TrkB and ERK1/2 phosphorylation increased (P0.05), as compared to the Ischemia/Reperfusion group, while the pretreatment with K252a, a TrkB receptor antagonist, reversed

5、the preconditioning-induced increase in TrkB and ERK1/2 activation (P0.05).Conclusion Ischemic preconditioning exerts the neuroprotective effect via the activation of BDNF-TrkB-ERK1/2 pathway.Key words: brain-derived neurotrophic factor; ischemia preconditioning; ischemic tolerance預(yù)先給予動物短時程全腦缺血刺激可對再

6、次嚴重的缺血刺激發(fā)生耐受，從而明顯減少海馬神經(jīng)元損傷1。腦缺血耐受神經(jīng)保護作用的分子信號機制還不很清楚。近年大量研究證明腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) 對缺血后的大腦神經(jīng)元有營養(yǎng)保護作用，并能促進損傷神經(jīng)元的修復(fù)。BDNF受體即酪氨酸激酶受體B(TrkB) 可特異性地結(jié)合BDNF從而直接或間接觸發(fā)信號傳遞的級聯(lián)反應(yīng)，如絲裂原應(yīng)激活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B即PI-3K/PKB(Akt)信號通路等2。在大多數(shù)情況下細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路激活是BDNF 發(fā)揮作用的優(yōu)勢途徑。本研究采用免疫印跡、免疫沉淀方法檢測大鼠全腦預(yù)缺血處理后BDNF表達、TrkB和下游

7、蛋白激酶ERK1/2磷酸化的水平變化，研究BDNF-TrkB-ERK信號通路是否參與預(yù)缺血的神經(jīng)保護作用，以及可能的臨床意義。1 材料和方法1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠，250280 g，清潔級，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。實驗動物隨機分為5組(n=5)：假手術(shù)組(sham組)、缺血/再灌注組(I/R組)、預(yù)缺血處理組(P組)、預(yù)缺血給藥組(P+K252a組)及預(yù)缺血溶劑對照組(P+DMSO組)。動物以20% 水合氯醛(300350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分離雙側(cè)頸總動脈并電凝椎動脈。I/R組于手術(shù)第2天動物清醒狀態(tài)下結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，使全腦缺血6 min并復(fù)灌。P組、P+K2

8、52a組及P+DMSO組于手術(shù)第2天給予3 min缺血，3天后再給予6 min缺血并復(fù)灌。缺血前大鼠處于清醒狀態(tài)，其生命體征完全正常。模型成功的標準是：缺血后3060 s內(nèi)翻正反射消失，四肢僵直，同時痛覺消失，雙側(cè)瞳孔散大等。sham組處理同實驗組，但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。1.2 試劑 p-ERK1/2兔多克隆抗體及TrkB拮抗劑K252a (Cell Signal公司 );抗ERK1/2多克隆抗體、 抗BDNF多克隆抗體、抗磷酸化酪氨酸p-tyr及抗TrkB多克隆抗體( Santa Cruz公司 ); 羊抗兔單克隆抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司 )。其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。1.3 給藥 K

9、252a以0.5 g/l的濃度溶解于1% dimethlysulfoxide (DMSO)，利用微量注射器通過側(cè)腦室于預(yù)缺血前20 min給藥(從前囟： 后開0.8 mm; 旁開1.5 mm; 深3.5 mm)，每只大鼠給藥10 l，10 min內(nèi)注完。注射同體積的DMSO作為陰性對照。1.4 檢測樣品的制備 大鼠缺血6 min再灌注10 min后，斷頭快速取腦，分離雙側(cè)海馬，置液氮中凍存?zhèn)溆?。以下操作均在冰水浴中進行：從液氮中取出海馬加勻漿緩沖液,用Glas-col勻漿器高速勻漿(10 s6次)，4下1 000 g離心15 min，小心移取上清液(主要為海馬的胞質(zhì)部分)備用。1.5 蛋白含量

10、測定 按Lowry等方法，以牛血清白蛋白為標準蛋白。1.6 免疫印跡(immunoblotting,IB) 等量蛋白樣品經(jīng)10%或15% SDS-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，以濕轉(zhuǎn)或半干轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至NC膜上。轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)3%BSA封閉后加入不同的稀釋后的一抗，4過夜。用洗滌液洗膜，加入相應(yīng)的二抗，室溫反應(yīng)2 h。洗膜后以NBT/BCIP顯色，結(jié)果以Image圖像分析軟件處理。1.7 免疫沉淀(immunoprecipitation,IP) 取蛋白樣品400 g，加入320 l 免疫沉淀緩沖液(IP buffer)。加DTT至終濃度為0.5 mmol/L，加入適量的一抗(抗TrkB抗體)，4 反應(yīng)12 h。再加入20 l 蛋白A，4 輕輕搖動2 h。 10 000 g2 min離心，沉淀用IP buffer 洗3遍。加等體積2SDS-PAGE樣品處理液，沸水浴5 min，離心取上清，7.5% SD