人胎盤泌乳素乳膠診斷試劑盒的研制①

1、人胎盤泌乳素乳膠診斷試劑盒的研制    人胎盤泌乳素乳膠診斷試劑盒的研制    中國免疫學(xué)雜志 1999年第11期第15卷 免疫學(xué)技術(shù)與方法    作者：王曉東李立梅周連福由家惠李玉珍付平平王彥忠    單位：王曉東李立梅周連福由家惠李玉珍吉林省計劃生育科研所，長春 130041；付平平白求恩醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)院，長春 130021；王彥忠吉林省醫(yī)院，長春 130021    關(guān)鍵詞：人胎盤泌乳素

2、；圍產(chǎn)期；胎盤功能    中國圖書分類號R446.6    摘要目的：根據(jù)聚苯乙烯乳膠對蛋白質(zhì)的良好吸附性能，通過對乳膠的化學(xué)改性，使其能夠同人胎盤泌乳素(Human placetal lactogen，HPL) 抗血清牢固聯(lián)接。方法：利用乳膠作為聯(lián)接HPL抗血清的載體，同孕婦血清進行凝集反應(yīng)。根據(jù)血清的稀釋倍數(shù)，半定量測定出HPL的濃度。結(jié)果：經(jīng)過對183例足月孕婦血清測定，并同時與單向免疫擴散法做相關(guān)性比較，兩者呈高度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.611，P0.001。結(jié)論：此方法可以作為圍產(chǎn)期檢查胎盤功能的一種新方法

3、。    Development of diagnosis kit for human placental lactogen (HPL) by latex    WANG Xiao-Dong,LI Li-Mei，ZHOU Lian-Fu et al    (Family Planning Institute of Jilin Province,Changchun 130041)    AbstractObjective：Accordin

4、g to the property of polystyrene latex that can adsorb Proteins perfectly anti-HPL serum was combined with latex that was modified Chemically.Methods：Latex that was linked with anti-hpl serum can act as a carrier that will agglutinate when it reacts with pregnancy' serum. The concentration of HP

5、L will be analyzed half quantitatively by serum dilution.Results：We analyzed 183 cases pregnancys' serums using latex agglutination and immunodiffusion .The results show that these two methods have high correlations, the correlation coefficient r=0.611(p0.001).Conclusion：Indicated that the latex

6、 agglutination kit could be a new method to detect peripartum placental function.    Key words Human placental lactogenPerinatologyPlacental function    自1956年Singer和Ploz首次報道以乳膠為載體建立免疫學(xué)診斷方法以來，乳膠凝集作為快速檢查方法，深受使用者歡迎。但由于乳膠本身的局限性和空間位阻效應(yīng)，使免疫活性物質(zhì)不能有效充分結(jié)合到乳膠表面1。所以目前國內(nèi)

7、多為聯(lián)接抗原的乳膠凝集抑制試驗，而能夠聯(lián)接抗體的乳膠報道甚少。經(jīng)資料查詢國內(nèi)未發(fā)現(xiàn)乳膠直接凝集試劑盒產(chǎn)品。我們經(jīng)過多年的試驗研究，采用化學(xué)修飾的方法，使合成的乳膠表面帶有活潑脂基團，可直接同抗血清聯(lián)接，方法簡單實用，并且成功地將人胎盤泌乳素（HPL）抗血清聯(lián)接到乳膠上，生產(chǎn)出HPL乳膠診斷試劑盒，現(xiàn)將實驗報道如下。    1材料與方法    1.1主要試劑Strrene 苯乙烯（國產(chǎn)），MES、2-N-嗎啡啉-乙磺酸（Serva公司），SDS、十二烷基磺酸鈉（Sigma公司），EDC、水溶性碳化二亞胺（Sigma公

8、司），HOBT、N-羥基苯丙三氮唑（Sigma公司）。    1.2HPL的提純及抗血清的制備 應(yīng)用正常足月產(chǎn)婦胎盤, 經(jīng)組織搗碎、離心、鹽析、柱層析、親合層析等手段，將HPL提純，然后按常規(guī)方法免疫家兔，制備HPL抗血清2。    1.3羧化聚苯乙烯的合成應(yīng)用3口圓底瓶，加入去離子水，在88水浴中300 r/min，恒溫攪拌，加入SDS，待溶后按比例依次加入無阻聚劑的苯乙烯純品、MES，連續(xù)攪拌6 h，由苯乙烯的汽油味變成杏仁味即為聚合完畢，合成后的乳膠為乳白色顆粒，直徑約為0.8 m，可采用高速離心進行顆粒篩選

9、。    1.4羧化乳膠的化學(xué)改性1 將合成的乳膠經(jīng)離子交換和離心除去水溶性物質(zhì)，包括表面活性劑、無機鹽、可溶性高分子聚合物、非電解質(zhì)等，然后按比例加入HOBT和EDC，目的是將羧基化乳膠進行化學(xué)改性，使羧基變成活潑脂基團，使免疫活性物質(zhì)能與乳膠聯(lián)接牢固。    1.5乳膠同提純后的HPL抗血清聯(lián)接 取化學(xué)改性的乳膠,用甘氨酸緩沖液(GBS)配成20%濃度, 分別加入1,2, 4mg/ml不同濃度的HPL抗血清, 在56恒溫水浴振蕩反應(yīng)24 h, 使HPL抗血清能充分同乳膠聯(lián)接, 經(jīng)10 000r/min, 30m

10、in離心洗滌3次, 洗滌液為加入1%兔血清的GBS,恢復(fù)原體積, 加入0.1%NaN3防腐。    2結(jié)果    2.1致敏乳膠的自凝檢測 在黑色背景的玻片上畫2.53.0 cm大小的漆圈為反應(yīng)板，將3批致敏HPL抗血清的乳膠分別配成1%濃度，各加入反應(yīng)板圓圈內(nèi)1滴（約30 l）。再加入GBS緩沖液1滴，慢慢搖動反應(yīng)板35 min，在明亮的光線下觀察各不同致敏濃度是否有自凝現(xiàn)象。經(jīng)過檢測，3個致敏濃度以2 mg/ml的致敏濃度為最佳，同GBS緩沖液無凝集，乳膠顆粒均勻，大小一致。   

11、 2.2非特異性凝集檢測將38例正常男性血清,分別稀釋20、40、80倍，分別加入反應(yīng)板1滴，再加入2 mg/ml致敏HPL抗血清乳膠1滴，連續(xù)慢慢搖動35 min，觀察是否有凝集反應(yīng)。經(jīng)測定38例男性血清各稀釋倍數(shù)均無凝集反應(yīng)，說明致敏的HPL抗血清乳膠同正常男性血清無非特異性凝集反應(yīng)。    2.3致敏乳膠的敏感度檢測 將提純的HPL參考標(biāo)準(zhǔn)抗原，用GBS稀釋成不同濃度2，分別加在反應(yīng)板1滴，再加入致敏乳膠1滴。慢慢搖動反應(yīng)板5 min，觀察各濃度的凝集反應(yīng)，以出現(xiàn)凝集的最低標(biāo)準(zhǔn)液濃度或標(biāo)準(zhǔn)液的最高稀釋倍數(shù)為判定終點，經(jīng)過測定，乳膠的敏感度

12、為0.125 mg/L。凝集明顯,顆粒均勻,界線清楚。    2.4致敏乳膠的穩(wěn)定性檢測 將致敏的乳膠試劑, 在4冰箱內(nèi)放置6個月后進行測定, 乳膠的敏感度和清晰度均未發(fā)生改變。效價穩(wěn)定，無自凝發(fā)生，說明致敏的乳膠試劑穩(wěn)定性符合要求。    2.5hpl乳膠法與hpl單向免疫擴散法的比較 將183例3742孕周的孕婦血清,分別稀釋為20、40、80倍，取各濃度血清1滴，加在反應(yīng)板上，再分別加入2mg/ml致敏的乳膠液1滴，搖動反應(yīng)板，5 min后判定結(jié)果，以出現(xiàn)明顯凝集顆粒為判定終點，根據(jù)乳膠法的敏感度為0.125

13、 mg/L,乳膠法半定量測定的HPL值為20倍2.5 mg/L，40倍5mg/L，80倍10mg/L。以20倍為危險值，40倍為異常值，80倍為正常值。同HPL單向免疫擴散法進行對照比較，單向免疫擴散法6 mg/L以下為異常值，6mg/L以上為正常值，結(jié)果見表1。    隨機抽取50例進行兩種方法的相關(guān)性比較,結(jié)果兩法測值呈高度相關(guān), 相關(guān)系數(shù)r=0.611，P0.001, 其直線回歸方程y=3.645+0.3184x5。    表1乳膠法與單向免疫擴散法測定HPL值比較   

14、0;Tab.1Comparison of hpl concentration between Latax agglutination and single immunodiffusion            Method    Cases    Concentration    of hpl6 mg/L    Con

15、centration    of hpl6 mg/L            Cases    %    Cases    %            HPL Latex   

16、; Agglutination    183    169    92.34    14    7.66            HPL single    Immunodiffusion   

17、0;183    160    87.43    23    12.57            3討論蛋白質(zhì)濃度對致敏效果影響很大，濃度低時反應(yīng)慢，敏感度低，凝集顆粒小，結(jié)果不易判定。濃度過高，因未結(jié)合的蛋白游離過多，會產(chǎn)生非特異性凝集反應(yīng)，因此必須選擇合適 的致敏濃度，經(jīng)過多次試驗，選擇2 mg/ml蛋白濃度較為理想

18、，但是所選擇的抗血清必須要純度高、效價高，因為乳膠表面的空間結(jié)構(gòu)是固定的，只有提高抗血清的純度和效價，才能提高試劑的敏感性和特異性。    乳膠顆粒的化學(xué)改性，是本研究的關(guān)鍵步驟，我們參考國內(nèi)外有關(guān)乳膠試劑的材料3，經(jīng)過多次實驗，找到了適合乳膠改性的條件，使乳膠的羧基改變?yōu)榛顫娭鶊F，使改性后的乳膠具有牢固聯(lián)接抗血清的能力，通過聯(lián)接HPL抗血清的成功，說明改性的乳膠也可以聯(lián)接其它不同種類的抗血清，應(yīng)用到其它檢測項目上，制備出各種反相乳膠凝集診斷試劑，這種直接反應(yīng)的乳膠凝集試驗，在傳統(tǒng)乳膠凝集方法的基礎(chǔ)上有很大的提高，使操作更加簡單方便。    經(jīng)過我們對183例孕婦血清的測定，并同時與單向免疫擴散法做相關(guān)性比較，證明兩法有良好的一致性，說明乳膠半定量測定方法，可以作為檢測胎盤功能的一種新方法，同其它方法相比，乳膠法具有簡單、快速、微量、價廉4。取耳垂血分離出10l血清即可滿足試驗要求，使受檢者容易接受。經(jīng)查閱有關(guān)文獻資料，未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)市場有此類乳膠產(chǎn)品，在未來快速診斷方法中，是很有開發(fā)價值的檢測方法。    吉林省科技發(fā)展計劃資助項目    作者簡介：王曉東，男，43歲，副研究