微藻接種及培養(yǎng)

1、藻種接種 接種就是把藻種接到新配好的培養(yǎng)液中的整個操作過程。接種過程雖很簡單，但應(yīng)注意藻種的質(zhì)量、接種藻液的數(shù)量和接種的時間三個問題。1、 藻種的質(zhì)量藻種的質(zhì)量對培養(yǎng)結(jié)果影響很大，一般應(yīng)選取無敵害生物污染、生活力強、生長旺盛的藻種來接種培養(yǎng)。外觀藻液的顏色正常，且無大量沉淀，無明顯附壁現(xiàn)象發(fā)生。2、 藻種的數(shù)量接種量和接種密度對提高產(chǎn)量甚為重要。接種量是指藻種的絕對數(shù)量；接種密度是指藻種接種后的密度。接種量，總的原則是“宜大不宜小”。室內(nèi)利用三角燒瓶、細(xì)口玻璃瓶等進(jìn)行藻種培養(yǎng)時，接種的藻液量與新配制的培養(yǎng)液量的比例為1:24。二級培養(yǎng)和三級培養(yǎng)由于培養(yǎng)容器容量大，接種量可根據(jù)具體情況靈活掌握，

2、但最少不低于1:50.（一般我們?nèi)壗臃N是1:20）3、 接種的時間一般來說，接種時間最好是在上午810時，不宜在晚上。因為不少藻類晚上藻細(xì)胞下沉，而白天藻細(xì)胞有趨光上浮的習(xí)性，尤其是具有運動能力的種類更明顯。上午810時一般是藻細(xì)胞上浮明顯的時候，此時接種可以吸取上浮的且運動能力強的藻細(xì)胞做藻種，棄去底部沉淀的藻細(xì)胞，起著擇優(yōu)的作用。藻種培養(yǎng)1、按微藻營養(yǎng)模式的不同，培養(yǎng)方式可分為光自養(yǎng)、混合營養(yǎng)和異養(yǎng)三種。（1）光自養(yǎng)培養(yǎng)光自養(yǎng)是微藻的自然營養(yǎng)方式。微藻的光合自養(yǎng)生長受到很多環(huán)境因素的影響，包括營養(yǎng)條件、光照、溫度、pH和通氣條件等。優(yōu)化上述因素以滿足微藻生長的需要，是光合自養(yǎng)條件下實現(xiàn)微

3、藻高密度培養(yǎng)的前提條件。目前實現(xiàn)微藻高密度光合自養(yǎng)培養(yǎng)主要采用三種方法：優(yōu)化微藻培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，采用不同稀釋比及分批補料培養(yǎng)避免底物抑制，或采用連續(xù)培養(yǎng)提高微藻生產(chǎn)率，以及開發(fā)具有高光能傳遞效率的光生物反應(yīng)器。優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可以提高微藻的生物量和代謝產(chǎn)物的積累。在發(fā)狀念珠藻細(xì)胞光合自養(yǎng)培養(yǎng)過程中，以BG11為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用中心組合設(shè)計對培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20d，發(fā)狀念珠藻細(xì)胞干重和多糖產(chǎn)量分別較優(yōu)化前增加了50.6%和34.9%?？等鹁甑仍?5L氣升式光生物反應(yīng)器中進(jìn)行了魚腥藻7120的光合自養(yǎng)培養(yǎng)條件優(yōu)化，在細(xì)胞生長的適宜條件下，變光強培養(yǎng)5d，藻細(xì)胞干重達(dá)

4、到1.5g/L，與文獻(xiàn)報道相似條件相比體積產(chǎn)率提高2.4倍。分批補料培養(yǎng)是在微藻分批培養(yǎng)中，以某種方式向培養(yǎng)系統(tǒng)補加一定物料的培養(yǎng)技術(shù)。通過向培養(yǎng)系統(tǒng)中補加物料，可以使培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物濃度較長時間地保持在一定范圍內(nèi)，既能保證微藻生長的需要，又不產(chǎn)生底物抑制，從而達(dá)到提高產(chǎn)率的目的。連續(xù)培養(yǎng)則通過以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同的速度流出培養(yǎng)液，從而使反應(yīng)器內(nèi)的液量維持恒定，微藻在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。Fabregas等對雨生紅球藻進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)的研究，在優(yōu)化的培養(yǎng)基中收獲的細(xì)胞干重是分批培養(yǎng)的3倍。（2）混合培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)多數(shù)微藻是光合自養(yǎng)生物，但有一些微藻具有利用有機碳源的能力。隨著

5、微藻利用有機物生長的現(xiàn)象不斷被發(fā)現(xiàn)，人們逐漸認(rèn)識到微藻具有一定的化能異養(yǎng)的能力。事實上，許多微藻生存的自然環(huán)境如土壤、水體，尤其是廢水中包含了大量的有機物質(zhì)，單從生理的角度分析，大多數(shù)微藻都應(yīng)具有進(jìn)行化能異養(yǎng)生長的能力。Vincent和Goldman認(rèn)為證明微藻在自然環(huán)境中進(jìn)行化能異養(yǎng)生長有4個依據(jù)：所利用有機物的濃度和供給速度的分析、攝入有機物的運輸系統(tǒng)的證據(jù)、在生理上利用有機物的能力的證據(jù)，以及有機物、光能和CO2對微藻生長的相對貢獻(xiàn)的評估。被微藻利用的有機物的范圍較廣，目前文獻(xiàn)報道的主要包括糖類、有機酸、氨基酸和某些醇類等。微藻利用有機物的能力因種而異，因此必須通過實驗來確定。微藻利用有

6、機物生長表現(xiàn)為兩種形式：一種是可以在完全黑暗的條件下利用有機物進(jìn)行化能異養(yǎng)生長，不再依賴光能，其表現(xiàn)與一般的化能異養(yǎng)生物并無差異；另一種則必須在一定的光照條件下才能利用有機物，即光能自養(yǎng)的同時進(jìn)行一定程度的化能自養(yǎng)，稱為混合混養(yǎng)。一般而言，能夠進(jìn)行異養(yǎng)生長的微藻都能進(jìn)行混合營養(yǎng)生長，且混合營養(yǎng)生長速度比異養(yǎng)生長速度快。例如，藍(lán)細(xì)菌只有30種左右可以進(jìn)行異養(yǎng)生長，但是約有半數(shù)的藍(lán)細(xì)菌可以進(jìn)行混合營養(yǎng)生長。與光合自養(yǎng)培養(yǎng)相比，混合營養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)具有生長速度快、對光的依賴減弱或不需要光照等優(yōu)點，有利于進(jìn)行微藻的高密度培養(yǎng)，是獲得大量微藻細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物的有效途徑，而封閉式光生物反應(yīng)器的研制開發(fā)為

7、微藻的異養(yǎng)和混合營養(yǎng)培養(yǎng)提供了必要條件。到目前為止，對混合培養(yǎng)生長過程的研究主要集中在螺旋藻、小球藻、集胞藻、魚腥藻和發(fā)狀念珠藻等。這些微藻混合營養(yǎng)生長的特征為：當(dāng)藻細(xì)胞密度較大時表現(xiàn)為線性生長；密度較小時，先對數(shù)生長，后線性生長。在相同光照強度下，混合營養(yǎng)生長速度為異養(yǎng)生長速度和光合自養(yǎng)生長速度之和。因此一般認(rèn)為微藻在進(jìn)行混合營養(yǎng)生長時，藻細(xì)胞內(nèi)光合自養(yǎng)和異養(yǎng)代謝是兩個獨立的過程。但是也有研究認(rèn)為微藻細(xì)胞內(nèi)兩個代謝過程相互影響。微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)方式排除了培養(yǎng)過程對光的需求，通過同化葡萄糖等有機物提供細(xì)胞生長所需的能量和結(jié)構(gòu)物質(zhì)，所有操作和整個培養(yǎng)過程是在無菌條件下進(jìn)行，可以利用傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵

8、罐進(jìn)行微藻的異養(yǎng)生長。由于有機物為碳源和能源，不受光照的限制，因此可以達(dá)到較高的培養(yǎng)濃度。但是異養(yǎng)培養(yǎng)也存在一些問題：可異養(yǎng)的藻種有限；培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，易被細(xì)菌污染；高濃度底物的抑制作用，難于合成光誘導(dǎo)產(chǎn)物。目前已經(jīng)報道可以異養(yǎng)的微藻只有小球藻、隱甲藻等少數(shù)幾種，其中小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)已經(jīng)實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，日本和我國臺灣用葡萄糖和乙酸作碳源在不銹鋼罐中異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)健康食品原料。2按培養(yǎng)方式不同可分為批次培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。2.1批次培養(yǎng)微藻批次培養(yǎng)模式具有操作簡單、成本低的優(yōu)點，是實驗室內(nèi)普遍采用的一種培養(yǎng)方式。在不同培養(yǎng)條件下，研究微藻細(xì)胞內(nèi)特定組分的積累規(guī)律和進(jìn)行最佳培養(yǎng)條

9、件的優(yōu)化，可為人工控制、調(diào)節(jié)和提高微藻生長和合成特定產(chǎn)物提供一種簡便易行的研究方式。微藻細(xì)胞內(nèi)某些組分的合成與微藻細(xì)胞生長階段密切相關(guān)。在微藻生長的不同階段，其胞內(nèi)各組分含量差異較大，如某些藻類的總脂肪含量在靜止期明顯高于其它時期。據(jù)報道，纖細(xì)角毛藻在靜止期末期總脂肪含量是指數(shù)生長期的9倍；裸甲藻靜止期的脂肪產(chǎn)量是對數(shù)生長末期的30倍，可達(dá)到30mg/（L·d）；微擬球藻靜止期的總脂肪含量是對數(shù)生長末期的1.3倍。對于大多數(shù)微藻來說，通過誘導(dǎo)可使細(xì)胞內(nèi)特定組分得到大量積累，即在營養(yǎng)鹽限制或者缺乏條件下才能大量合成特定組分，在這種情況下，采用批次培養(yǎng)便于嚴(yán)格控制誘導(dǎo)條件，有利于獲得目標(biāo)

10、產(chǎn)物。氮是微藻生長最重要的營養(yǎng)元素之一，大量研究已經(jīng)證明，氮缺乏可誘導(dǎo)油脂、蝦青素和-胡蘿卜素含量的明顯增加，其中以缺氮誘導(dǎo)提高微藻油脂含量方面的研究最多。在氮缺乏條件下脂肪含量明顯提高，微綠球藻UTEXLB1999提高1.5倍，微擬球藻（Nannochloropsissp.F&MM24）提高了2倍，土壤藻（Neochlorisoleoabundans）提高了將近4倍，普通小球藻（C.vulgaris）提高了22%，另一種小球藻（C.emersonii）提高了34%。此外，缺氮條件也有利于鹽藻胞內(nèi)-胡蘿卜素的積累。有報道稱，在缺氮條件下，鹽藻胞內(nèi)-胡蘿卜素含量可高達(dá)57.4pg，是高氮

11、培養(yǎng)條件下的2倍左右。缺氮也可誘導(dǎo)雨生紅球藻蝦青素的大量積累，Borowitzka報道，雨生紅球藻的綠色游動細(xì)胞在含0.01g/LKNO3培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d即全部轉(zhuǎn)變成紅色細(xì)胞，當(dāng)KNO3濃度為0.1g/L時，培養(yǎng)38d時才有部分紅色細(xì)胞形成。由此可見，批次培養(yǎng)有利于實現(xiàn)特定誘導(dǎo)條件，在大規(guī)模生產(chǎn)特定目標(biāo)產(chǎn)物的培養(yǎng)中發(fā)揮著重要作用。近年來，利用微藻處理污水也是微藻培養(yǎng)的研究熱點之一。用微藻處理污水，主要目的是去除污水中的氮、磷或者重金屬等污染物，通過微藻培養(yǎng)，使污水中的污染物降到很低的水平，以期達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。在這種情況下，采用批次培養(yǎng)模式可充分利用微藻生長有效去除污染物，尤其是去除雙價金屬離子

12、的能力是其它培養(yǎng)模式所不能比擬的。綜上所述，批次培養(yǎng)模式操作簡單、成本較低，在研究不同條件下微藻的生長及特定物質(zhì)積累中得到了廣泛的應(yīng)用。在進(jìn)行批次培養(yǎng)時，微藻消耗營養(yǎng)鹽尤其是氮、磷的速度較快，容易造成培養(yǎng)液中氮、磷營養(yǎng)鹽的缺乏，藻細(xì)胞的生長和增殖受到限制，在這種條件下，藻細(xì)胞內(nèi)可積累一些特定的物質(zhì)（如油脂、類胡蘿卜素等）。近年來，批次培養(yǎng)在“兩步法”藻細(xì)胞特定產(chǎn)物的規(guī)模培養(yǎng)中得到了較廣泛的應(yīng)用，第一步提供足夠的營養(yǎng)鹽進(jìn)行批次培養(yǎng)，使藻細(xì)胞積累較高的生物量，第二步實現(xiàn)營養(yǎng)元素的缺乏或限制，從而提高微藻體內(nèi)特定目標(biāo)產(chǎn)物的含量。由此可見，批次培養(yǎng)有利于實現(xiàn)誘導(dǎo)條件，在誘導(dǎo)產(chǎn)油、產(chǎn)蝦青素和產(chǎn)胡蘿卜素的

13、大規(guī)模培養(yǎng)中發(fā)揮著獨特的作用。2.2流加培養(yǎng)流加培養(yǎng)也稱為分批補料培養(yǎng),是指在培養(yǎng)中間歇或連續(xù)向反應(yīng)器中加入一種或多種營養(yǎng)物質(zhì)，但不同時取出培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法，其基本特點是通過改變進(jìn)料速率控制反應(yīng)器中的營養(yǎng)物濃度，在藻類培養(yǎng)中有較多的應(yīng)用。在微藻培養(yǎng)中，碳、氮、磷是微藻培養(yǎng)必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，但對于部分藻種而言，過高的CO2、氨或磷濃度會對微藻的生長產(chǎn)生抑制或毒害作用。采用分批補料培養(yǎng)模式，能有效解除營養(yǎng)鹽抑制效應(yīng)，同時還能維持微藻生長所適宜的培養(yǎng)環(huán)境。與分批培養(yǎng)相比，分批補料培養(yǎng)能夠較好地控制培養(yǎng)液中營養(yǎng)鹽的濃度、顯著提高微藻生物量和最終目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，并且能夠有效提高營養(yǎng)鹽的利用率。在產(chǎn)烴葡

14、萄藻的培養(yǎng)中，通過流加KNO3和K2HP04，能將產(chǎn)烴葡萄藻的生物量從分批培養(yǎng)的1.3 g/L提高至1.9 g/L，并且烴含量提高了7%;在小球藻和柵藻的培養(yǎng)中流加氮源，可以延長藻細(xì)胞的線性生長期，最終生物量比分批培養(yǎng)分別提高了0.68 g/L和0.99 g/L。 分批補料培養(yǎng)的發(fā)展至今，種類眾多。按補料方式分，有連續(xù)流加、半連續(xù)流加和多周期流加;按流加速率分，有恒速流加、指數(shù)流加和變速流加;按反應(yīng)器的體積分，有恒體積流加和變體積流加;按反應(yīng)器的數(shù)目分，有單級和多級;按有無反饋分，又有反饋控制流加和無反饋控制流加。Braue從物料流入速率和流出速率對分批補料培養(yǎng)進(jìn)行了分類(圖1-8 )。 微藻

15、分批補料培養(yǎng)中常用恒速流加和變速流加方式，分別是以均勻的速度和非線性的速度進(jìn)行一種或多種營養(yǎng)鹽的補加。然而，一般采用的恒速流加或變速流加都是按照預(yù)先設(shè)定的規(guī)律加以控制，雖然操作比較簡單，但是不能真實反映微藻培養(yǎng)中營養(yǎng)鹽濃度的變化，屬于前饋控制流加，需要控制模型絕對的精確才能較好的控制營養(yǎng)鹽的水平。此外，若培養(yǎng)中出現(xiàn)意外狀況時(如藻狀態(tài)不佳生長緩慢、培養(yǎng)條件突然改變、微藻生長受到污染等)，這種補料方式?jīng)]有應(yīng)變性。如果要根據(jù)藻細(xì)胞的生長狀態(tài)適時調(diào)整微藻培養(yǎng)液中營養(yǎng)鹽濃度，必須進(jìn)行反饋控制流加，即通過檢測培養(yǎng)中某些重要參數(shù)的變化，來確定相應(yīng)營養(yǎng)鹽的流加速率。反饋控制流加能夠控制培養(yǎng)液中營養(yǎng)鹽水平基本

16、穩(wěn)定，從而維持適合細(xì)胞或某種代謝產(chǎn)物生成的環(huán)境穩(wěn)定，比盲目的恒速流加及變速流加更有利于生物量或產(chǎn)物的積累。 反饋控制流加又可以分為直接反饋流加和間接反饋流加。直接反饋流加是通過在線測定培養(yǎng)液中某種限制性營養(yǎng)鹽濃度的大小，及時調(diào)整流加速率，將營養(yǎng)鹽濃度控制在預(yù)期范圍內(nèi)。但目前只有少數(shù)幾種營養(yǎng)鹽(如氨、硝酸根等)能夠?qū)崿F(xiàn)在線測量，而且容易受到培養(yǎng)液中其它離子或有機物質(zhì)的影響，誤差較大，因此其應(yīng)用范圍受到了限制。間接反饋流加是通過對一些能夠反映細(xì)胞代謝及營養(yǎng)鹽變化規(guī)律的外部參數(shù)，如CO2消耗速率( CUR)、溶氧(DO)、pH、生物量等進(jìn)行檢測，作為控制流加速率的依據(jù)。目前，間接反饋流加多用于微生物

17、培養(yǎng)。 在微藻培養(yǎng)中，采用反饋控制營養(yǎng)鹽流加的方法還鮮有報道。 隨著對分批補料培養(yǎng)研究的深入，在補料方式、優(yōu)化控制等方面都取得了很大進(jìn)展，雖然仍然是一種介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的過渡培養(yǎng)方式，但在某些情況下，如多級重復(fù)補料，分批補料培養(yǎng)的概念淡化，己非常接近于連續(xù)培養(yǎng)。采用分批補料培養(yǎng)能解決分批培養(yǎng)中營養(yǎng)鹽限制或抑制的問題，延長微藻的線性生長期，提高產(chǎn)量。在微藻培養(yǎng)特別是高密度微藻培養(yǎng)中有著非常重要的意義。2.3半連續(xù)培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)是在一次性培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，當(dāng)藻細(xì)胞達(dá)到一定濃度后，收獲一定量的藻液，補充等量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。半連續(xù)培養(yǎng)不僅廣泛用于大規(guī)模培養(yǎng)，也是微藻實驗室研究中常用的培養(yǎng)模式。在

18、半連續(xù)培養(yǎng)過程中，由于定時采用新鮮培養(yǎng)液替代等量的原培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分增加，生物密度下降，透光率增加，因此，藻體光合效率增強，生長速率增快，有利于藻細(xì)胞保持良好的生長狀態(tài)。更新率作為半連續(xù)培養(yǎng)模式中最重要的參數(shù)之一，對微藻的生長和細(xì)胞內(nèi)生化組分都有重要的影響。當(dāng)外界條件一定時，特定藻株的最適更新率是一定的。當(dāng)更新率過高時，造成培養(yǎng)液中藻細(xì)胞濃度很低，即使補充充足的營養(yǎng)鹽，單個細(xì)胞的生長速率達(dá)到最大，單位體積培養(yǎng)液的生物量仍然很低；反之，當(dāng)更新率較低時，造成藻細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)鹽不足，光強較弱，嚴(yán)重影響生物量的積累，從而影響藻細(xì)胞的產(chǎn)率。在很多情況下，半連續(xù)培養(yǎng)微藻的更新率為20%30%

19、，如雨生紅球藻、淡水微藻（Parietochlorisincise）在20%更新率下的細(xì)胞產(chǎn)率達(dá)最大值，明顯高于其它更新率的細(xì)胞產(chǎn)率；杜氏藻（Dunaliellatertiolecta）在20%30%更新率下的日采收量可高達(dá)3×106個/（mL·d），分別是40%，50%更新率時的1.5倍和2倍；綠色巴夫藻、隱藻（Chroomonassp.）的細(xì)胞產(chǎn)率也在更新率為30%時達(dá)到最高值。由于微藻更新率不僅影響微藻的細(xì)胞密度，而且影響微藻的生長速率，因此可在合適的更新率條件下結(jié)合營養(yǎng)鹽的限制添加，在不降低生物量的同時促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)油脂的積累，為微藻生物質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)以及微藻生物能源的

20、發(fā)展提供重要的培養(yǎng)技術(shù)。在更新率為25%并限制添加氮源的條件下，小球藻（chlorellasp.）的油脂產(chǎn)率達(dá)最大值，為0.139g/（L·d），明顯高于批次培養(yǎng)模式和流加培養(yǎng)模式；當(dāng)更新率為40%時，在室外大規(guī)模培養(yǎng)微擬球藻（Nannochloropsissp.F&M-M24），在限氮條件下每天的油脂產(chǎn)率可達(dá)204mg/（L·d），比營養(yǎng)鹽充足的對照組高87mg/（L·d）。據(jù)此推算，該藻的產(chǎn)油量可達(dá)20t/（a·hm2），從而證明了微藻生物質(zhì)規(guī)模培養(yǎng)的可行性；當(dāng)更新率為50%時，微擬球藻（N.oculataNCTU-3）生物量和油脂產(chǎn)率分別可

21、以達(dá)到0.497g/（L·d）和0.151g/（L·d），比更新率為60%時分別高0.201g/（L·d），0.030g/（L·d）。近年來，半連續(xù)培養(yǎng)在微藻油脂積累方面的應(yīng)用研究越來越多，實踐證明，半連續(xù)培養(yǎng)模式是微藻規(guī)模生產(chǎn)生物柴油的最佳培養(yǎng)方式之一。在半連續(xù)培養(yǎng)模式下，不同微藻的最適更新率有所不同，不同培養(yǎng)系統(tǒng)中微藻的最適更新率差異也較大。因此，在進(jìn)行半連續(xù)培養(yǎng)時，須要根據(jù)不同的藻種及培養(yǎng)系統(tǒng)選擇合適的更新率，以提高大規(guī)模培養(yǎng)微藻的生物質(zhì)產(chǎn)量。2.4連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是指以一定的流速連續(xù)向培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)液，同時以相同的速度流出培養(yǎng)液，使反應(yīng)器

22、內(nèi)的細(xì)胞生長環(huán)境處于恒定狀態(tài)。這種恒定狀態(tài)使細(xì)胞生長處于一個穩(wěn)定的環(huán)境中，細(xì)胞的生長速度、代謝活性處于相對恒定的狀態(tài)，從而達(dá)到穩(wěn)定高速培養(yǎng)微藻或產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物的目的。稀釋率是連續(xù)培養(yǎng)模式中最重要的參數(shù)，它直接影響微藻的生物質(zhì)產(chǎn)量、細(xì)胞產(chǎn)率以及代謝產(chǎn)物的積累。大多數(shù)微藻在一定稀釋率范圍內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)時，生物量隨著稀釋率的增加而增加，當(dāng)稀釋率超過臨界值后，藻細(xì)胞未能充分生長便被沖走，生物量反而會隨著稀釋率的增加而下降。大量研究表明，微藻連續(xù)培養(yǎng)時都存在一個最佳稀釋率，如杜氏鹽藻、三角褐指藻的最佳稀釋率為0.15d-1、柵藻為0.31d-1，藻細(xì)胞在最佳稀釋率下生長，達(dá)到穩(wěn)態(tài)時的生物量明顯高于其它稀釋

23、率下的生物量。有些微藻在合適的稀釋率下進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)時，其生物量產(chǎn)率明顯高于批次培養(yǎng)的生物量產(chǎn)率。雨生紅球藻在氮充足、稀釋率為0.9d-1條件下的生物量產(chǎn)率可高達(dá)1.2g/（L·d），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于批次培養(yǎng)時的產(chǎn)率0.1g/（L·d）；魯茲帕夫藻（Pavlovalutheri）在稀釋率為0.297d-1時的生物量產(chǎn)率比批次培養(yǎng)高0.084g/（L·d）；當(dāng)細(xì)胞濃度較低時，螺旋藻批次培養(yǎng)的生物量產(chǎn)率大于連續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度較高時，連續(xù)培養(yǎng)的生物量產(chǎn)率大于批次培養(yǎng)，且在稀釋率為0.45d-1時，生物量產(chǎn)率達(dá)到最大值。以特定稀釋率進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)時，微藻細(xì)胞處在一個穩(wěn)定的環(huán)境中生長

24、，細(xì)胞代謝活動相對穩(wěn)定，從而能夠高效穩(wěn)定地產(chǎn)生某些重要的代謝產(chǎn)物。研究表明，與批次培養(yǎng)相比，連續(xù)培養(yǎng)模式更有利于某些微藻細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的積累，如單針藻（MonoraphidiumspGK12）在稀釋率為0.64d-1時，細(xì)胞內(nèi)蝦青素的含量能夠達(dá)到0.30.4pg，明顯高于批式培養(yǎng)的含量；富含PUFA的魯茲帕夫藻（Pavlovalutheri）在稀釋率為0.297d-1時，EPA和DHA的產(chǎn)率均高于批次培養(yǎng)的產(chǎn)率；當(dāng)稀釋率為0.9d-1，硝酸鹽濃度為1.7mM時，雨生紅球藻誘導(dǎo)產(chǎn)蝦青素的厚壁孢子，得到最大的脂肪酸含量為7.6%，這比非連續(xù)培養(yǎng)下的油脂含量高4.3%。以最佳稀釋率進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)時，細(xì)

25、胞的生長環(huán)境相對穩(wěn)定，細(xì)胞處于優(yōu)化的生長條件下，從而使細(xì)胞生理代謝達(dá)到一種穩(wěn)定狀態(tài)，微藻生長穩(wěn)定且生長速率快，藻細(xì)胞穩(wěn)定的生長狀態(tài)對于微藻合成某些重要次生代謝產(chǎn)物具有重要作用。因此，連續(xù)培養(yǎng)不論是在穩(wěn)定高產(chǎn)微藻生物質(zhì)方面，還是在穩(wěn)定生產(chǎn)某些重要代謝產(chǎn)物方面，都發(fā)揮著其它模式所不能替代的作用。3、 培養(yǎng)條件環(huán)境因素是影響藻類生長和代謝的主要因素之一。在不同的環(huán)境條件影響下，一種藻的生長狀態(tài)和內(nèi)部能量變化都產(chǎn)生微妙的變化。在掌握了環(huán)境因素對藻類培養(yǎng)的影響后，即可以做到在實驗時排除不必要的影響因子，使得實驗的關(guān)鍵因素可以更加準(zhǔn)確，穩(wěn)定。實驗中各變量是在其他相關(guān)量確定的基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整。以此來尋找到一個

26、最佳的試驗條件。同時，為了提高數(shù)據(jù)可靠性與準(zhǔn)確性，實驗中的各項數(shù)據(jù)均為與平行樣的平均值。3.1培養(yǎng)溫度單細(xì)胞藻類在光合作用的過程中，需要一定的溫度范圍。溫度的變化例如升溫或者降溫的時候會對光合作用有一定的促進(jìn)或者抑制作用。有研究指出光合作用和呼吸作用的強度都會被溫度所影響，而這兩大支柱卻都是和微藻的生長代謝有著緊密的關(guān)系。并且微藻屬于生態(tài)熱型微生物，它們必須從環(huán)境中得到熱源，溫度的大幅度變化會導(dǎo)致生長速率，新陳代謝效率和細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)速度。因此培養(yǎng)時的溫度是影響單細(xì)胞微藻生長的重要因素之一。微藻可以適應(yīng)的溫度往往在1540之間。而且不同種類的微藻所適應(yīng)的范圍也有所不同。單細(xì)胞的綠藻小球藻最適合的溫度上限在36左右，而最合適的溫度應(yīng)在2532之間。在一組實驗中，為了確定的無光培養(yǎng)狀態(tài)下，在其他因素穩(wěn)定的條件里，找到最節(jié)能而且效率最高的的培養(yǎng)溫度。該實驗中的溫度變化分為20、25、30、32幾個標(biāo)準(zhǔn)。光照為0lux;初始pH為68;搖速為160rpm;通氣量為50mL/d;培養(yǎng)基為BG培養(yǎng)基;葡萄糖碳源濃度為1g/L，培養(yǎng)72h。通過上表3所示，可以看出當(dāng)培養(yǎng)溫度在275和30時，吸光度(540nm)相同且最大，也就是藻體濃度最大，