正交設(shè)計法優(yōu)化超聲破壁提取麥冬皂苷D的工藝研究(一)

1、正交設(shè)計法優(yōu)化超聲破壁提取麥冬皂苷D的工藝研究(一)作者：趙燕燕 張向飛 王麗娟 王翠玲 蘇芳【摘要】 目的通過觀察麥冬細胞超聲破壁時間和利用紫外分光光度法檢測超聲提取麥冬皂苷D含量兩種考察指標來比較篩選麥冬皂苷D的提取條件，優(yōu)化超聲提取工藝。方法采用正交設(shè)計法，分別以麥冬細胞破壁時間和采用紫外分光光度法測定麥冬細胞破壁后皂苷D的含量為考察指標，考察乙醇濃度、溫度、麥冬粒度和先期浸泡時間等因素對超聲提取工藝的影響。通過顯微鏡觀察，確定細胞破壁狀況；通過對兩種考察指標的實驗結(jié)果進行比較，優(yōu)化提取方案。結(jié)果利用紫外分光光度法測定麥冬皂苷D含量和通過觀察麥冬細胞破壁所篩選的麥冬皂苷D最佳提取工藝的結(jié)

2、果是一致的。在考察因素中，麥冬皂苷提取工藝影響程度為：粒度乙醇濃度先期浸泡時間溫度，超聲提取最佳條件為：溫度45 ，80 目粒度，95% 乙醇，先期浸泡12 h。結(jié)論通過超聲方法對中草藥有效成分進行提取，其提取率與細胞破壁有關(guān)，利用正交實驗分析紫外分光光度法檢測麥冬皂苷D含量和考察麥冬細胞破碎的結(jié)果是一致的，可通過觀察麥冬細胞破壁結(jié)果來優(yōu)化提取工藝，簡化操作。 【關(guān)鍵詞】 超聲； 細胞破壁； 麥冬皂苷D； 正交設(shè)計法； 工藝篩選麥冬Ophiopogon japonicus（Thunb.）Ker-Gaw11為百合科沿階草屬植物，是常用滋陰中藥，其味甘微苦，性微寒，歸心、肺、胃經(jīng)，具有養(yǎng)陰潤肺、益

3、胃生津、清心除煩的功效，傳統(tǒng)中醫(yī)主要將其用于肺、胃、心陰不足的病癥。中草藥中許多有效成分為細胞內(nèi)成分，提取時需要破碎細胞壁，而現(xiàn)有的化學和機械方法破碎細胞很難起到理想的破碎效果2，影響提取率。超聲提取包括機械粉碎、熱學及空化作用3，4，由于3個方面的綜合作用，加速了細胞的破碎，提高了有效成分的提出率。采用超聲方法提取中草藥中有效成分的文獻已有很多 511，但通過超聲方法考察細胞壁破碎情況與提取效率的關(guān)系尚未見文獻報道。本實驗采用正交設(shè)計法，分別以麥冬細胞破壁時間和采用紫外分光光度法測定麥冬細胞破壁后皂苷D的含量為考察指標，考察了乙醇濃度、溫度、麥冬粒度和先期浸泡時間等因素對超聲提取工藝的影響，

4、通過顯微鏡觀察確定細胞壁破碎狀況；通過對兩種考察指標實驗結(jié)果的比較，優(yōu)化提取方案。1 儀器與材料UV2550 SHIMADZU紫外分光光度計（日本島津）；KQ5200E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Olympus X 40細胞生物顯微鏡（日本Olympus）；RT-5型中藥粉碎機（浙江縉云縣超力機械廠）；BS 224S型電子分析天平（北京塞多利斯天平有限公司）。麥冬，購自河北安國中藥市場，產(chǎn)于四川，經(jīng)鑒定本品為百合科沿階草屬植物麥冬的干草塊莖；麥冬皂苷D標準品（含量98%，天津一方科技有限公司）；高氯酸（分析純，天津東方化工廠）。2 方法與結(jié)果2.1 正交實驗設(shè)計及各因素水平設(shè)定選

5、取溶液溫度（A）、麥冬粒度（B）、乙醇濃度（C）和浸泡時間（D）為主要考察因素，各因素的水平設(shè)定見表1。正交實驗采用L9（34）正交表12，見表2。表1 超聲破碎提取麥冬皂苷D實驗水平（略）2.2 超聲對麥冬細胞破壁的影響稱取過80 目篩麥冬粉末5.0 g，加入 100 ml 95% 乙醇，先期浸泡12 h，在45 條件下，超聲30 min后，顯微鏡下觀察其超聲前后細胞壁變化情況（見圖12）。結(jié)果表明，超聲能使麥冬細胞壁破碎。2.3 標準曲線的繪制精密稱取麥冬皂苷D 7.0 mg，置于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容，精密吸取0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，5.0

6、 ml標準溶液置于具塞試管中，揮干溶劑，加高氯酸10 ml，密塞，于60 水浴加熱15 min，冰水浴冷卻，終止反應(yīng)，以高氯酸作為空白對照，在295 nm和313 nm波長處測其吸收值。以濃度C對吸收差值A(chǔ)作圖，得到麥冬皂苷D的標準曲線方程為A=0.299 C+0.008，相關(guān)系數(shù)為0.999 1。線性范圍為0.735.0 mgL-1。2.4 重復性實驗稱取過80目篩麥冬粉末5.0 g，放入具塞三角瓶中，用100 ml的95%乙醇溶液浸泡12 h。浸泡后在45 恒溫下，超聲波振蕩提取1 h，將提取液進行抽濾。然后將濾液移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至干。向瓶中加入5 ml的高氯酸，密塞，60水浴加熱15

7、 min，冰水終止反應(yīng)，以高氯酸作空白對照，進行紫外分光度檢測。重復進行6次，所得結(jié)果RSD=0.97%，表明重復性良好。2.5 超聲破壁提取麥冬皂苷D正交實驗結(jié)果將麥冬藥材粉碎，過篩，得到80，40，20目麥冬粉末。分別稱取麥冬粉末適量，用100 ml溶劑浸泡一定時間，在一定溫度下進行超聲破碎，每隔5 min取樣，顯微鏡觀察，確定細胞破壁時間。將提取液抽濾，濾渣用少量蒸餾水沖冼，然后將濾液移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至干；向瓶中加入5 ml的高氯酸，密塞，60水浴加熱15 min，冰水終止反應(yīng)，以高氯酸作空白對照，采用紫外分光光度法檢測。分別采用極差法和方差分析法對正交實驗的兩個結(jié)果分別進行分析，確

8、定各因素對實驗結(jié)果的影響程度（見表23）。方差分析結(jié)果表明，通過紫外分光光度法檢測麥冬皂苷D含量和利用觀察麥冬細胞破壁時間來篩選麥冬皂苷D最佳提取工藝結(jié)果是一致的。影響提取率的主次因素為BCDA，即粒度乙醇濃度先期浸泡時間溫度；最佳超聲提取工藝為A2B1C2D2，即45 條件下，80目粒度，95% 乙醇，先期浸泡12 h。表2 超聲破壁提取麥冬皂苷D正交實驗設(shè)計直觀分析結(jié)果（略）圖1 超聲前麥冬細胞圖（4010）（略）圖2 超聲后麥冬細胞圖（4010）（略）表3 超聲破壁提取麥冬皂苷D正交實驗方差分析結(jié)果（略）本結(jié)果運用正交實驗助手軟件計算，表示有顯著性（P0.05）3 討論3.1 粉碎粒度對

9、細胞超聲破壁的影響實驗結(jié)果表明，粉碎粒度為2060目時，超聲2 h后細胞輪廓無顯著變化；在80目時，經(jīng)超聲0.5 h麥冬細胞壁破碎，粉碎粒度與細胞超聲破壁成正比，與正交實驗分析結(jié)果是一致的。3.2 超聲溫度和先期浸泡時間對細胞破壁的影響在麥冬皂苷D超聲提取過程中，溫度因素和先期浸泡時間影響不顯著。在實際提取操作中，一般采取較低的溫度，以減少有效成分的降解，同時可以省去先期浸泡程序，簡化操作步驟。通過超聲方法對中草藥有效成分進行提取，其提取率與細胞破壁有關(guān)，利用正交實驗分析紫外分光光度法檢測麥冬皂苷D含量和觀察麥冬細胞破碎狀況的結(jié)果是一致的，因此，可利用考察麥冬細胞破壁結(jié)果來優(yōu)化提取工藝，簡化操作，降低成本，縮減工作量?！緟⒖嘉墨I】目的通過觀察麥冬細胞超聲破壁時間和利用紫外分光光度法檢測超聲提取麥冬皂苷D含量兩種考察指標來比較篩選麥冬皂苷D的提取條件，優(yōu)化超聲提取工藝。方法采用正交設(shè)計法，分別以麥冬細胞破壁時間和采用紫外分光光度法測定麥冬細胞破壁后皂苷D的含量為考察指標，考察乙醇濃度、溫度、麥冬粒度和先期浸泡時間等因素對超聲提取工藝的影響。通過顯微鏡觀察，確定細胞破壁狀況；通過對兩種考察指標的實驗結(jié)果進行比較，優(yōu)化提取方案。結(jié)果利用紫外分光光度法測定麥冬皂苷D含量和通過觀察麥冬細胞破壁所篩選的麥冬皂苷D最佳提取工藝的結(jié)果是一致的。在考察因素中，麥冬皂苷提取工藝影響程