眼瞼皮膚惡性黑色素瘤早期檢測(cè)進(jìn)展

1、眼瞼皮膚惡性黑色素瘤早期檢測(cè)進(jìn)展    【摘要】 眼瞼皮膚惡黑瘤發(fā)病率低，預(yù)后差，在臨床及病理上很難與其他腫瘤鑒別。本文回顧了國(guó)內(nèi)外眼瞼皮膚惡黑瘤相關(guān)基因、腫瘤標(biāo)志物的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)B-RAF、hTERT、NOS及melan-A均與眼瞼皮膚惡性黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展，早期檢測(cè)相關(guān)，有利其鑒別診斷。    【關(guān)鍵詞】 眼瞼惡性黑色素瘤基因早期檢測(cè) The advances on early detection of eyelid malignant melanoma    Abstra

2、ct Eyelid malignant melanoma is rare but has a grave prognosis. It is very difficult to differentiate eyelid malignant melanoma and other tumors in clinical and pathological. Studies on the correlated genes, tumor markers in eyelid malignant melanomas are reviewed in the present paper. The results s

3、how B-RAF, hTERT, NOS and melan-A contributed to the eyelid malignant melanomas in onset, progress and early detection which are advantageous for differential diagnosis.    ? KEYWORDS: eyelid; malignant melanoma; gene; early detection 0引言    眼瞼皮膚惡黑瘤占眼瞼腫瘤不到1%，占

4、眼瞼惡性腫瘤5.4%，發(fā)生率在我國(guó)居眼瞼惡性腫瘤第4位，近年呈增加趨勢(shì)。目前眼瞼皮膚惡黑瘤的診斷即腫瘤病理活檢及黑素細(xì)胞抗體HMB45，S-100蛋白免疫組化分析。近年腫瘤研究不斷深入，更多腫瘤標(biāo)志物、相關(guān)基因開(kāi)始用在眼瞼皮膚惡黑瘤的早期檢測(cè)中。    1 B-RAF與眼瞼皮膚惡黑瘤    Raf是一類(lèi)進(jìn)化保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是Raf-Ras-MEK-ERK-MAPK(MEK: mitogen/extracecullar signal-regulated kinase; ERK: extracecullar

5、signal-regulated kinase; MAPK: mitogen-activated protein kinase)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要成員，在細(xì)胞增殖、分化、生長(zhǎng)、及凋亡中起重要的調(diào)控作用。B-RAF原癌基因又名鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性毒菌（V-Raf）致癌同源體B1，受其上游RAS蛋白激酶的調(diào)控，為脊椎動(dòng)物細(xì)胞中Raf家族成員，它可通過(guò)其mRNA的不同剪接產(chǎn)生大小不同的分子，行使不同功能。通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞株基因組DNA突變篩選后證明B-RAF原癌基因在60%以上的惡性黑色素瘤及少數(shù)的腸癌、甲狀腺癌、肺癌、卵巢癌等多種腫瘤中都有突變1。曾有試驗(yàn)將突變的B-RAF基因轉(zhuǎn)染到黑色素細(xì)胞中，使其表

6、型發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變，將該細(xì)胞株接種到裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其呈侵襲性生長(zhǎng)，并導(dǎo)致腫瘤形成2。所有的B-RAF原癌基因突變都限定于激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)，主要突變發(fā)生在15（89%）外顯子上，其中約92%位于第1799核苷酸上，導(dǎo)致其編碼的谷氨酸被纈氨酸取代（V600E），此種錯(cuò)義突變使B-RAF激酶活性發(fā)生改變，持續(xù)激活ERK、MEK和MAPK通道，使前有絲分裂原有效分裂能力增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和分化，從而形成腫瘤。ERK被激活后活性增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲、改變整合素的表達(dá)、降低E-鈣黏素表達(dá)及增加基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）分泌3。采用特異性MEK激酶抑制劑阻斷B-RAF突變引起的下游信號(hào)通路的激活，如口腔內(nèi)給藥

7、CI1040就能有效抑制鼠的惡黑瘤肺轉(zhuǎn)移，并能使已產(chǎn)生的肺轉(zhuǎn)移灶縮小甚至消失4。而 MAPK通路的激活被認(rèn)為是促進(jìn)細(xì)胞非控制性的分裂，它通過(guò)傳遞胞外分裂信號(hào)在黑色素瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中扮演重要角色。MAPK信號(hào)傳遞抑制劑如LeTx（炭疽致死毒素)及小分子MAPK激酶抑制劑均能觸發(fā)人黑色素瘤細(xì)胞凋亡2。    有學(xué)者通過(guò)研究spitzoid黑色素病變中B-RAF, N-RAS, 和 H-RAS 3種基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)spitzoid惡黑瘤及其轉(zhuǎn)移癌中均有86%發(fā)生B-RAF或N-RAS變異，疑為惡黑瘤的色素性病變中35%存在B-RAF或N-RAS的變異，Spit

8、z痣和非典型Spitz痣中均未發(fā)現(xiàn)3種基因的變異。Spitz痣和非典型Spitz痣及疑為腫瘤的病變中測(cè)到H-RAS變異率各為29%、14%及7%，spitzoid惡黑瘤中表達(dá)陰性。因此提示鑒別診斷良惡性spitzoid黑色素病變中B-RAF及相關(guān)基因變異分析可作為輔助診斷工具5。而Uribe等6認(rèn)為B-RAF變異在良性和非典型黑素細(xì)胞痣及惡黑瘤三者中的表達(dá)并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且其變異情況與惡黑瘤Clark's分級(jí)無(wú)關(guān)?，F(xiàn)有資料表明B-RAF突變狀態(tài)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及臨床結(jié)局有關(guān)，可能是一種新的惡性腫瘤相關(guān)基因，新的基因治療靶點(diǎn)。但對(duì)B-RAF突變的研究只有短時(shí)間幾年研究，尚缺乏大規(guī)模

9、、系統(tǒng)而深入的研究，仍有較多有爭(zhēng)議的問(wèn)題需進(jìn)一步闡明。    2人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）與眼瞼皮膚惡黑瘤    端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端，由串聯(lián)排列的重復(fù)DNA序列和端粒結(jié)合蛋白構(gòu)成的特殊結(jié)構(gòu)，在染色體復(fù)制及保護(hù)染色體穩(wěn)定中起重要作用。正常人類(lèi)體細(xì)胞每分裂一次丟失50200bp，端?？s短到一定程度后，細(xì)胞就會(huì)衰老死亡。端粒酶為一具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的核糖核蛋白體，以自身RNA組分為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成端粒的重要序列，加入到縮短了的端粒中去補(bǔ)償細(xì)胞分裂時(shí)染色體末端端粒的縮短，維持其原有長(zhǎng)度使細(xì)胞“永生化” 7。對(duì)人

10、類(lèi)來(lái)說(shuō)，端粒酶活性出現(xiàn)在大多數(shù)胚胎組織，正常成年男性生殖細(xì)胞、炎性細(xì)胞、更新組織的增生細(xì)胞及大多數(shù)腫瘤細(xì)胞。端粒酶由人端粒酶RNA（hTR）, 端粒酶相關(guān)蛋白（TP1/TLP1）和人端粒酶催化亞單位/人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTRT/ hTERT）3個(gè)亞單位組成。到現(xiàn)在為止，hTERT在大部分惡性腫瘤中表達(dá)，在正常組織（除生殖細(xì)胞和有高度復(fù)制潛能的體細(xì)胞）中不表達(dá)。而其他兩種成分在腫瘤組織和正常組織中均有不同程度的表達(dá)8。曾有試驗(yàn)研究hTR及hTERT各自在乳腺癌、甲狀腺癌及惡黑瘤中的表達(dá)，表明只有hTERT可作為腫瘤患者血漿中一非特異性腫瘤標(biāo)志物9。    

11、據(jù)報(bào)道端粒酶在消化、泌尿、血液、呼吸等系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)均呈陽(yáng)性，從良性痣到非典型痣再到惡黑瘤及轉(zhuǎn)移性惡黑瘤其活性持續(xù)增高，活性高低與腫瘤分化程度，臨床分期密切相關(guān)10，且與hTERT陽(yáng)性表達(dá)顯著正相關(guān)，受hTERT轉(zhuǎn)錄和選擇剪接的調(diào)節(jié)控制 11?，F(xiàn)認(rèn)為端粒酶可用于腫瘤篩查，判定腫瘤惡性程度及患者預(yù)后7 ，hTERT的檢測(cè)可作為端粒酶活性研究指標(biāo)12。國(guó)內(nèi)研究顯示hTERT陽(yáng)性表達(dá)隨黑素細(xì)胞良惡性變化而逐漸增加，hTERT陽(yáng)性細(xì)胞也見(jiàn)于良性黑素細(xì)胞，說(shuō)明端粒酶激活只代表細(xì)胞增生活躍或獲得一定程度永生化能力，但不是惡性腫瘤特有，當(dāng)該酶激活能力很高達(dá)一定閾值，細(xì)胞才獲得永生化能力發(fā)展為惡性腫瘤13

12、。各種痣中hTERT陽(yáng)性細(xì)胞可能已具有進(jìn)一步演變?yōu)閻汉诹龅臐撃?，追蹤hTERT陽(yáng)性痣病變患者將有助于早期發(fā)現(xiàn)惡黑瘤，提示對(duì)hTERT檢測(cè)在惡黑瘤早期檢測(cè)方面具有良好臨床應(yīng)用前景14。但有報(bào)道hTERT仍不能作為原發(fā)黑色素病變的輔助組織學(xué)診斷，其原因尚不清楚15。    3一氧化氮合酶NOS與眼瞼皮膚惡黑瘤    一氧化氮NO主要在體內(nèi)參與血管舒張、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)、巨噬細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒等多功能調(diào)節(jié)，介導(dǎo)DNA損傷參與早期腫瘤形成過(guò)程，通過(guò)刺激腫瘤細(xì)胞侵襲性，誘導(dǎo)血管生成，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。它由一氧

13、化氮合酶NOS家族合成，包括神經(jīng)型NOS(nNOS ),內(nèi)皮型NOS（eNOS）和誘導(dǎo)型NOS（iNOS）。前兩者主要分布在神經(jīng)組織和血管內(nèi)皮，產(chǎn)生短時(shí)效、少量NO，作為神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)節(jié)局部血流。后者主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)效、大量NO，具有多種不同功能。    目前研究較為深入的是iNOS，正常情況下機(jī)體不合成有活性的iNOS，病理過(guò)程如炎癥反應(yīng)、腫瘤和自身免疫反應(yīng)等情況下，巨噬細(xì)胞可活化產(chǎn)生iNOS，釋放大量NO從而殺傷腫瘤細(xì)胞和病原微生物，同時(shí)NO又是一種自由基，可直接或通過(guò)分解成許多小分子毒性物質(zhì)損傷細(xì)胞。大量研究表明iNOS在神經(jīng)細(xì)胞瘤、胃癌

14、、肝癌、結(jié)腸腺癌、乳腺癌等都有較高的表達(dá)，并作為雙刃劍在不同情況下發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、抑制和殺傷腫瘤的作用16。iNOS在色素痣中無(wú)表達(dá)，在惡黑瘤中卻頻繁表達(dá)，特別是轉(zhuǎn)移型，推測(cè)iNOS在黑素細(xì)胞惡變，腫瘤生長(zhǎng)中扮演重要角色，可能是一有效惡性黑色素病變的免疫組化指標(biāo)17，且其陽(yáng)性表達(dá)率與患者生存時(shí)間反比，因此可將其作為評(píng)價(jià)惡黑瘤轉(zhuǎn)移，侵襲及預(yù)后的指標(biāo)之一18。而 eNOS及nNOS的水平和（或）活性在惡黑瘤中有較色素痣和正常黑素細(xì)胞高的表達(dá)，推測(cè)由此種酶產(chǎn)生的NO可能具有舒張惡黑瘤血管，促進(jìn)其生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移的功能19.20。最近研究發(fā)現(xiàn)黑素瘤細(xì)胞和色素痣細(xì)胞中iNOS和eNOS陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、差異，轉(zhuǎn)移與無(wú)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中結(jié)論相反，表明兩者在促進(jìn)惡黑瘤生長(zhǎng)和腫瘤血管生成中起一定作用，可考慮作為惡黑瘤是否轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一。而黑素瘤細(xì)胞和色素痣細(xì)胞中nNOS陽(yáng)性表達(dá)率具顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在轉(zhuǎn)移與無(wú)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中結(jié)論相反。因此nNOS可考慮作為惡黑瘤與色素痣鑒別的指標(biāo)21。但這僅是推測(cè)，無(wú)直接證據(jù)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于iNOS釋放的NO對(duì)惡黑瘤細(xì)胞的凋亡及轉(zhuǎn)移作用問(wèn)題上仍有很大爭(zhēng)議，需進(jìn)一步研究NOS在惡黑瘤中的作用機(jī)制。    4 Melan-A檢測(cè)與眼瞼皮膚惡黑瘤    Melan-A蛋白是MART（melanoma a

16、ntigen recognized by T cells）-1基因的一種產(chǎn)物，常用抗體A103檢測(cè)，近年被認(rèn)為是一種辨別黑色素病變的有效抗原。采用免疫組化使用單克隆抗體A103評(píng)估原發(fā)皮膚惡黑瘤中melan-A表達(dá)情況及其與腫瘤分期和生存率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)melan-A不僅是原發(fā)皮膚惡黑瘤的特異性診斷標(biāo)志物，且有助于改善惡黑瘤患者預(yù)后22?，F(xiàn)有專(zhuān)家提出3種免疫標(biāo)志物單克隆抗體最佳濃度聯(lián)合溶液，即MART1(M2-7C10)、melan-A(A103)和Tyrosinase(酪氨酸酶T311)，被稱(chēng)為“MCW”黑素瘤雞尾酒，在判定惡黑瘤的微小轉(zhuǎn)移病灶中具較高檢測(cè)率23。  

17、60; 由于眼瞼皮膚惡黑瘤形態(tài)復(fù)雜，臨床上對(duì)其組織病理診斷仍存在一定問(wèn)題，因此免疫組化檢測(cè)在其確診過(guò)程中起重要作用。常用免疫組化標(biāo)志物即黑素細(xì)胞抗體HMB45 ，能識(shí)別前黑素小體球蛋白，僅對(duì)惡黑瘤和向惡黑瘤分化的其他腫瘤呈陽(yáng)性表達(dá)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HMB45對(duì)惡黑瘤有高度特異性，視為惡黑瘤首選抗體。隨著免疫組化的廣泛開(kāi)展，在血管平滑肌脂肪瘤、透明細(xì)胞瘤、間質(zhì)細(xì)胞腫瘤中HMB45也能表達(dá)24。其次S100蛋白，主要存在于神經(jīng)組織及其腫瘤和惡黑瘤中，其敏感性特別強(qiáng)，無(wú)論原發(fā)瘤或轉(zhuǎn)移瘤，標(biāo)記百分率均為100，且與惡黑瘤的分化程度與組織學(xué)類(lèi)型無(wú)關(guān)，因而對(duì)其標(biāo)記為陰性的惡性腫瘤可作出排除惡黑瘤的診

18、斷。Heegaard S25曾比較melan-A、S100、HMB45分別在結(jié)膜、虹膜、睫狀體及脈絡(luò)膜惡黑瘤中的表達(dá)，結(jié)果顯示melan-A在結(jié)膜及虹膜惡黑瘤中敏感度較HMB45 高，在脈絡(luò)膜惡黑瘤中兩者相似。虹膜惡黑瘤中melan-A染色特異性較S100高，提示melan-A可能成為檢測(cè)眼球惡性黑色素病變的一輔助標(biāo)志。其他專(zhuān)家通過(guò)免疫組化半定量研究提示melan-A可鑒別非色素性腫瘤和原發(fā)，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，敏感度、特異性強(qiáng)于HMB45，但在檢測(cè)梭形細(xì)胞及結(jié)締組織增生性黑色素瘤時(shí)其價(jià)值仍不及S10026,27。    5展望與問(wèn)題  

19、  因眼瞼皮膚惡黑瘤發(fā)展迅速，易廣泛轉(zhuǎn)移，惡性度高，治療棘手。早期診斷，及時(shí)正確治療非常重要，建議對(duì)于疑似惡黑瘤的眼瞼病變均應(yīng)早期行活組織病檢，但因眼瞼皮膚惡黑瘤組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)變化多樣，憑臨床及病理特征診斷仍有一定困難，因此對(duì)其應(yīng)用更多的組織病理技術(shù)，如B-RAF變態(tài)分析、運(yùn)用TRAP或PCR測(cè)定hTERT、免疫組化分析NOS及melan-A在組織中的表達(dá)，對(duì)眼瞼皮膚惡黑瘤的鑒別會(huì)發(fā)揮重要作用。但對(duì)此腫瘤研究時(shí)間尚短，許多問(wèn)題上存在爭(zhēng)議，因此還需進(jìn)一步行更深入，廣泛的研究試驗(yàn)。 【參考文獻(xiàn)】 1尹香利,張國(guó)昌. BRAF原癌基因與甲狀腺癌關(guān)系的研究進(jìn)展.陜西醫(yī)學(xué)雜志,2

20、006;35(3):324-3272 Collisson EA, De A, Suzuki H, Gambhir SS, Kolodney MS. Treatment of metastatic melanoma with an orally available inhibitor of the Ras-Raf-MAPK cascade. Cancer Research ,2003;63(18):5669-56733 Smalley KS. A pivotal role for ERK in malignant melanoma. Int J Cancer,2003; 104(5):527-5

21、324 Wellbrock C, Ogilvie L, Hedley D, Karasarides M, Martin J, Niculescu-Duvaz D, Springer CJ, Marais R. V599EB-RAF is an oncogene in melanocytes. Cancer Research ,2004;64(7):2338-23425 van Dijk MC, Bernsen MR, Ruiter DJ. Analysis of Mutations in B-RAF, N-RAS, and H-RAS Genes in the Differential Dia

22、gnosis of Spitz Nevus and Spitzoid Melanoma. Am J Surgical Pathology,2005;29(9):1145-11516 Uribe P, Wistuba II, Gonzalez S. BRAF Mutation: A Frequent Event in Benign, Atypical, and Malignant Melanocytic Lesions of the Skin. Am J Dermatopathology,2003;25(5):365-3707孟秀娟.端粒酶在腫瘤疾病中的表達(dá)及研究進(jìn)展.河北醫(yī)藥,2003;25(

23、4):305-306 8 Wu A, Ichihashi M, Ueda M. Correlation of the expression of human telomerase subunits with telomerase activity in nomal skin and skin tumors. Cancer ,1999; 86(10):2038-20449 Novakovic S, Hocevar M, Zgajnar J, Besic N, Stegel V. Detection of telomerase RNA in the plasma of patients with

24、breast cancer, malignant melanoma or thyroid cancer. Oncology Reports ,2004;11(1):245-252    10 Miracco C, Pacenti L, Santopietro R, Laurini L, Biagioli M, Luzi P. Evaluation of telomerase activity in cutaneous melanocytic proliferations. Human Pathology,2000; 31(9):1018-102111 V

25、illa R, Porta CD, Folini M. Possible regulation of telomerase activity by transcription and alternative splicing of telomerase reverse transcriptase in human melanoma. J Invest Dermatology ,2001;116(6):867-87312范松青,魏?jiǎn)⒂?原位雜交法檢測(cè)惡性黑色素瘤中人類(lèi)端粒酶RNA及人類(lèi)端粒酶催化亞單位mRNA的表達(dá).中華皮膚科雜志,2001;34(4):29213李慎秋,熊芬,張春梅. hTER

26、T在原發(fā)性皮膚惡性黑色素瘤中的表達(dá).華中科技大學(xué)學(xué)報(bào),2006;35(2):244-24614 Rudolph P, Schubert C, Tamm S, Heidorn K, Hauschild A, Michalska I, Majewski S, Krupp G, Jablonska S, Parwaresch R. Telomerase activity in melanocytic lesions: A potential marker of tumor biology. Am J Pathology ,2000;156(4):1425-143215 Fullen DR, Zhu

27、W, Thomas D, Su LD. hTERT expression in melanocytic lesions: an immunohistochemical study on paraffin-embedded tissue. Ournal Cutaneous Pathology,2005;32(10):680-68416 陶娟,涂亞庭. 一氧化氮、一氧化氮合酶與惡性黑色素瘤.國(guó)外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊(cè),2004;30(1):44-4717 Massi D, Franchi A, Sardi I, Magnelli L, Paglierani M, Borgognoni L, Maria

28、 Reali U, Santucci M. Inducible nitric oxide synthase expression in benign and malignant cutaneous melanocytic lesions. J Pathology ,2001;194(2):194-20018 Ekmekcioglu S, Ellerhorst J, Smid CM, Prieto VG, Munsell M, Buzaid AC, Grimm EA. Inducible nitric oxide synthase and nitrotyrosine in human metas

29、tatic melanoma tumors correlate with poor survival. Clinical Cancer Research ,2000; 6(12):4768-477519 Salvucci O, Carsana M, Bersani I, Tragni G, Anichini A. Antiapoptotic role of endogenous nitric oxide in human melanoma cells. Cancer Research ,2001;61(1): 318-32620 Joshi M, Strandhoy J, White WL.

30、nitric oxide synthase activity is upregulated in melanoma cell lines: a potential mechanism for metastases formation. Melanoma Res ,1996;6(2):121-12621李琛,孫桂珍,劉厚廣,張新萍. 一氧化氮合酶在惡性黑色素瘤皮損中的表達(dá).哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005;39(2):169-17422 Berset M, Cerottini JP, Guggisberg D, Romero P, Burri F, Rimoldi D, Panizzon RG. Expression of Melan-A/MART-1 antigen as a prognostic factor in primary cutaneous melanoma. Inter J Cancer ,