單純皰疹病毒I型胸苷激酶基因部分缺失重組質粒的構建及序列分析

1、    單純皰疹病毒I型胸苷激酶基因部分缺失 重組質粒的構建及序列分析        關鍵詞：單純皰疹病毒胸苷激酶基因缺失突變序列分析摘要：目的：構建HSV-1型胸苷激酶基因部分缺失的重組質粒并進行序列測定。方法：以pUC18/TK重組質粒DNA為模板，用PCR方法擴增TK5端503bp基因片段，并將擴增的片段克隆入載體pUC18中(pUC18/TK1)；用PstI和Hind雙酶切pUC18/TK，獲得TK3端383bp片段，將此酶切片段克隆入pUC18/TK1中，

2、并進行測序。結果：構建成重組質粒pUC18/TK。經酶切鑒定獲得1條約900bp的基因片段；序列測定證實,HSV-1 17synTK基因缺失了第493744位251對堿基。結論：成功地構建了部分缺失的HSV-1/TK基因重組質粒，為研制其突變株奠定了基礎。中國書資料分類號：Q78R373.11Construction and seguencing recombinat plasmid of the thymidine kinase gene deletion mutation of herpes smplex virus type IZhen Rongfen, Yu Qigui, Chen W

3、ei， Fan Rong, Xue Caifang (Laboratory of Anti? infectious Diseases,the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032) Keywords：herpes simplex virus thymidine kinase deletion mutation seguencing mutation Abstract：Aim:Constructing and seguencing recombinated plasmid of the thymidine kinase gene

4、 deletion mutation of herpes smplex virus type I (HSV-1). Methods: The 5-TK 503bp was amplified by PCR. And the TK genic DNA of HSV-1 17syn strain in the recombinated plasmid pUC18(pUC18/TK) was used as tamplate. The amplified fragment was cloned into pUC18 vector（ pUC18/TK1）. Then the pUC18/TK was

5、cleaved with both pst I and Hind III enzymes. The 3-TK 383bp fragment was obtained and cloned into plasmid pUC18/TK1. It's sequence was analysed. Results:The recombination plasmid pUC18/TK was constructed. The 251 bp from location 493 to 744 of TK gene of HSV-1 17syn strain was deleted in the pl

6、asmid pUC18/TK . The other part of the sequence did not vary. Conclusion:The recombinated plasmid of HSV-1/TK in which part genome was delected was successfully constructed.The plasmid pUC18/TK laid a good fundation for further constructing TK deletion mutant of HSV-1. 單純皰疹病毒I型（herpes simplex virus

7、type I,HSV-I）的胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因為其早期基因,若發(fā)生突變則形成突變株tk()HSV-I,能在鼠三叉神經節(jié)細胞等非分裂細胞中建立潛伏感染，但不能激活1，故對正常神經細胞無破壞作用。但tk()HSV-I能感染分裂細胞(如神經膠質瘤細胞和視網膜瘤細胞等)，并能在這些細胞中增殖，使之溶解破壞2。體外研究表明，tk()HSV-I突變株可殺傷U87和L19等神經膠質瘤細胞3,4。經皮下、腎包膜下及顱內右前葉直接注射tk()HSV-I突變株于荷神經膠質瘤的裸鼠及具有免疫活性的大鼠體內，可使腫瘤組織發(fā)生壞死，但不破壞正常組織。因此,本研究擬構建部分缺失的HSV

8、-1/TK基因重組質粒,以為進一步構建TK基因部分缺失的重組HSV-1突變株奠定基礎。1材料和方法1.1質粒重組質粒pUC18/TK(含HSV-1 17syn株TK基因的全部編碼區(qū)序列),由本室構建5。1.2引物通過計算機輔助分析，根據HSV-1 17synTK基因序列，在其5端設計一段引物（引物1），引入EcoRI酶切位點；根據HSV-1 17synTK基因第468492位堿基序列，設計一段反向引物（引物2）,并引入PstI酶切位點。引物由美國OperonTechnologies公司合成。其序列如：引物1:For:5-CGGAATTCATGGCTTCGTACCCCTGCCATCA-3引物2:

9、Rev:5-TACTGCAGATGGCGGTCGAAGATGAGGGTGA-31.3質粒的提取、酶切、連接及轉錄主要方法均參照分子克隆一書進行。1.4HSV-1 17synTK基因部分序列（503bp）重組質粒的構建PCR反應體系：模板為本室構建的重組質粒pUC18/TK600ng,引物1For和引物2Rev各1mol/L，4種dNTP各200 mol/L，3mmol/LMgCl2,5 l10×PCR緩沖液，總體積501。PCR反應液經100煮沸變性5min后，每管加入Taq聚合酶0.8U,以201液體石蠟油封面后，進行PCR擴增：即941min,601min,72延伸90s,共35

10、個循環(huán)。然后于72延伸10min。PCR產物在含0.5mg/L溴化乙錠(EB)的10g/L瓊脂糖凝膠中電泳,在紫外燈下觀察結果。經10g/L低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收503bp片段。用SurePure DNA Extraction Kit(Embi Tec公司產品)純化回收的DNA片段。經EcoR I和Pst I雙酶切后,克隆入經相應酶切后制備的pUC18載體中,轉化感受態(tài)JM109細菌。將得到的陽性克隆，經PCR及EcoR I和Pst I雙酶切鑒定，命名為pUC18/TK1重組質粒。1.5HSV-1TK基因部分缺失重組質粒的構建用Pst I和Hind III雙酶切pUC18/TK重組質粒，回收

11、TK3端383bp的片段；克隆入用同種酶切消化的pUC18/TK1中，轉化感受態(tài)JM109細菌，將得到的陽性克隆，經PCR及EcoR I和Hind III雙酶切鑒定，命名為pUC18/TK重組質粒（1）。1pUC18/TK重組質粒的構建Fig 1 Construction of recombinat plasmid pUC18/TK1.6pUC18/TK序列的測定pUC18/TK重組質粒經用QIAGEN公司產品QIAamp Tip25-Kit純化后，由美國夏威夷大學生物中心Neil博士在Applied Biosystems Model 373A Version全自動序分析儀中進行5測序。2結果

12、2.1pUC18/TK1重組質粒DNA的鑒定用引物1For和引物2Rev，對pUC18/TK重質粒進行擴增。將擴增產物克隆入pUC18載體中，經轉化得到的陽性克隆，用EcoR I及Pst I雙酶切和PCR鑒定，獲得預期的503bp基因片段（2）。2重組pUC18/TK1的PCR鑒定Fig 2 Identification of the recombinant plasmid pUC18/TK1 by PCR 1,2,3 and 5: Positive colonies;4 and 9: DNA molecular weight markers;6 and 7: Negative colonie

13、s 2.2pUC18/TK重組質粒DNA的鑒定將構建的pUC18/TK重組質粒，用EcoR I和Hind III雙酶切消化及PCR擴增鑒定，得到1條預期約900bp的基因片段(3)。3重組pUC18/TK質粒的酶切鑒定Fig 3 Identification of the recombinant pUC18/TK plasmid with EcoRI and Hind III1:Negative control; 2:DNA molecular weight makers; 3,4,5,6 and 7:Positive colonies 2.3pUC18/TK重組質粒DNA的序列測定序列測定的

14、結果顯示,pUC18/TK重組質粒DNA缺失了HSV-117Syn株TK基因第493744位251對堿基序列，其余基因序列相同。缺失后的TK基因序列約為900bp（4）。4pUC18/TK重組質粒的DNA序列Fig 4 Nucleotide sequence of the recombinant plasmid pUC18/TKDotted line shows deletion of nucleotide sequence 3討論TK基因是腫瘤基因治療中應用最多、最重要的藥物敏感靶基因之一。將HSV-1TK基因克隆入腺病毒或逆轉錄病毒載體中，經包裝細胞包裝成對快速分裂的細胞具有感染性的重組病

15、毒，將其感染腫瘤病毒細胞，使TK基因與腫瘤細胞基因組DNA整合，便可成為抗皰疹病毒核苷類藥物(如無環(huán)鳥苷和丙氧鳥苷等)的靶基因，達到殺傷腫瘤細胞的目的。將TK基因去除一小段克隆入載體中，與野生型HSV-1TK基因組DNA在活細胞內重組后，可篩選出HSV-1TK基因部分缺失的突變株，這種突變株不能在正常神經膠質細胞中增殖，但能在膠質細胞瘤細胞等快速分裂的神經細胞中增殖并使之溶解破壞，因而可用重組的HSV-1TK基因部分缺失的突變株治療神經膠質瘤等腦部的惡性腫瘤。本研究采用生物工程技術，將HSV-117synTK基因的5端503bp片段與3端383bp片段連接，構建成缺失第493744位251對堿

16、基序列的TK基因載體，為構建TK基因部分缺失的重組HSV-1突變株，治療神經膠質瘤等腦部惡性腫瘤奠定了基礎。*?國家自然科學基金資助項目，NO.39570807作者簡介：甄榮芬，女，52歲，副教授。西安市長樂西路17號,Tel(029)3374536作者單位：第四軍醫(yī)大學基礎部抗感染研究室，西安，710032參考文獻1Coen DM, Kosz-Vnenchak M, Jacobson JG, et al.Thymidine kinase-negative herpes simpex virus mutants establish lantency in mouse trigeminal bu

17、t do not reactivate. Proc Natl Acad Sci USA,1989;86(12):47364740 2Robert LM, Amy M, James MM, et al. Exprimental therapy of human glioma by means of a genetically engineered virus mutant. Sience,1991; 252(5007):854856 3James MM, Amy M, Donald MC. Reduction and elimination of encephalitis in an experimental glioma therapy model with attenuated herpes simplex mutants that retain susceptibility to acyclovir. Neurosurgery.1993; 32(4):5