不同來源降香中柚皮素與異甘草素含量的高效液相色譜測定

1、不同來源降香中柚皮素與異甘草素含量的高效液相色譜測定 10-08-22 14:04:00 編輯：studa20 作者：孫麗麗，王蕾，郭麗冰，沈志濱【摘要】 目的建立高效液相色譜（HPLC）法測定降香中柚皮素和異甘草素含量的方法，比較不同來源的11批降香藥材中的柚皮素和異甘草素的含量。方法采用HPLC法測定，以甲醇-0.2%磷酸水(6040) 為流動相，檢測波長為372nm（柚皮素）和290 nm（異甘草素）。結果柚皮素在0.9484.740 g范圍內線性關系良好，r=0.999 9；異甘草素在1.43210.024 g范圍內線性關系良好，r=0.999 9。降香中的柚皮素含量在2.5855.4

2、29 mg/g之間；異甘草素含量在7.52628.329 mg/g之間。結論不同來源的降香藥材中的柚皮素和異甘草素含量差異較大。該方法操作簡便、快速、重復性好，適用于降香的質量控制。 【關鍵詞】 高效液相色譜法； 降香； 柚皮素； 異甘草素降香Lignum dalbergiae Odoriferae主要含有揮發(fā)油和黃酮類成分。中國藥典中對于降香的質量控制僅限于規(guī)定降香醇溶性浸出物不得少于8.0%1，但是對單一成分未有明確的定量方法。本課題組對降香黃酮類成分進行了研究，從中分離得到7個化合物2。本文用自制的柚皮素和異甘草素為指標，建立HPLC含量測定方法，并測定了11個不同來源的降香藥材中的柚皮

3、素和異甘草素含量。1 儀器與試藥 Waters高效液相色譜儀（四元泵，二極管陣列檢測器，自動進樣）；柚皮素、異甘草素對照品（實驗室自制，經(jīng)UV、1H-NMR鑒定結構，HPLC檢測，面積歸一化法計算，純度大于98%）；甲醇為色譜純、乙醇等試劑為分析純。 本實驗所用降香樣品的來源見表1。表1 不同來源降香樣品（略）2 方法與結果2.1 對照品溶液的制備精密稱取柚皮素對照品4.74 mg于5 ml容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為0.948 mg/ml溶液，再經(jīng)0.45 m濾膜濾過得柚皮素對照品溶液。 精密稱取異甘草素對照品7.16 mg于5 ml容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配制成

4、質量濃度為1.432 mg/ml溶液，再經(jīng)0.45 m濾膜濾過得異甘草素對照品溶液。2.2 供試品溶液的制備按照正交實驗的結果，精密稱取各樣品粗粉2 g，在90下用70%乙醇提取3次，1.5 h/次，合并提取液，蒸干。殘留物用70%乙醇溶解并定容至25 ml。經(jīng)0.45 m濾膜濾過得供試品溶液。2.3 HPLC含量測定2.3.1 色譜條件色譜柱為迪馬公司Diamonsil C18(200 mm4.6 mm，5 m)色譜柱；流動相為甲醇-0.2%磷酸水(6040)；體積流量為1.0 ml/min；柚皮素的檢測波長為372 nm，異甘草素的檢測波長為290 nm；進樣量為10 l；柱溫30。2.3

5、.2 檢測波長的確定 紫外掃描柚皮素對照品溶液顯示其最大吸收在372 nm處，異甘草素對照品溶液最大吸收為290 nm。因此以此波長作為含量測定的檢測波長。2.3.3 線性關系考察柚皮素工作曲線：按“2.3.1”項下色譜條件，分別吸取柚皮素對照品溶液1，2，3，4，5 l進樣測定，記錄峰面積，結果見表2。以峰面積10-6為縱坐標，樣品量為橫坐標繪制標準曲線并計算得回歸方程為Y=5.570 6X -1.8206，r=0.999 9，線性范圍是0.9484.740 g。表2 柚皮素進樣量與峰面積（略） 異甘草素工作曲線：按“2.3.1”項下色譜條件，分別吸取異甘草素對照品溶液1，2，3，4，5，7

6、 l進樣測定，記錄峰面積。結果見表3。以峰面積10-6為縱坐標，樣品量為橫坐標繪制標準曲線并計算得回歸方程為Y=3.521 8X -1.575 2，r=0.999 5，線性范圍是1.43210.024 g。表3 異甘草素進樣量與峰面積（略）2.3.4 精密度考察精密吸取柚皮素對照品溶液5l，按“2.3.1”項下色譜條件測定其峰面積，連續(xù)操作7次。測定結果為 =4.685g，RSD=0.61%(n=7)。說明儀器精密度良好。 10-08-22 14:04:00 編輯：studa202.3.5 穩(wěn)定性考察精密吸取降香供試品溶液5 l，在0，1，3，6，12 h，按“2.3.1”項下色譜條件測定柚皮

7、素和異甘草素的峰面積，分別以柚皮素和異甘草素工作曲線計算。柚皮素的測定結果為 =4.668 g，RSD=0.47%(n=5)，提示樣品中柚皮素含量在12 h內穩(wěn)定。異甘草素測定結果為 =7.092 g，RSD=1.01%(n=5)，提示樣品中異甘草素含量在12 h內穩(wěn)定。結果見表4。表4 柚皮素和異甘草素穩(wěn)定性考察（略）2.3.6 重復性考察取同一號樣品5份，按供試品溶液制備方法平行處理，依法測定，求得RSD為1.43%。說明該方法重復性良好。2.3.7 各樣品的含量測定精密吸取樣品溶液10 l，按“2.3.1”項下色譜條件測定柚皮素的峰面積，以柚皮素的工作曲線計算各樣品中的柚皮素含量，同樣測

8、定異甘草素的峰面積，以異甘草素的工作曲線計算各樣品中的異甘草素含量。結果見表5。表5 各樣品中柚皮素和異甘草素含量（略） 本實驗對11個市售降香藥材的分析表明，降香中的柚皮素含量在2.5855.429 mg/g之間，異甘草素含量在7.52628.329 mg/g之間。 降香樣品（以樣品1為例）在372 nm和290 nm下的HPLC圖譜見圖12。3 討論 降香中含有多種黃酮類成分。其中，本實驗已分離出的柚皮素和異甘草素含量較大且其藥理活性與降香藥材的藥理作用相似，故選用這兩種化合物為指標測定含量，為降香的質量控制奠定理論基礎。 通過正交設計實驗對提取總黃酮的次數(shù)、時間、溫度和乙醇濃度進行了考察

9、，確定了本文的提取方法。 本實驗選用的兩種對照品異甘草素和柚皮素經(jīng)紫外掃描分別在290 nm和372 nm處有最大吸收。使用PDA檢測器，得到200400 nm范圍內的全波長圖譜，分別選取290 nm和372 nm下的HPLC分離得到的紫外吸收圖譜，建立各自的工作曲線，并測定相應波長下的峰面積從而定量。 選擇流速1.0 ml/min，調整甲醇、水的比例，發(fā)現(xiàn)當兩者比例為64時分離較好，但是峰形不夠好。所以在流動相中加入一定比例的磷酸，當流動相為甲醇-0.2%磷酸水(6040)時，異甘草素和柚皮素的峰均能較好的與其他峰實現(xiàn)分離。 實驗表明降香藥材中的異甘草素含量高于柚皮素含量。從廣西購入的降香中

10、柚皮素與異甘草素含量均較高。實驗結果顯示不同來源的降香藥材中柚皮素與異甘草素的含量差異較大。 本研究建立了HPLC法測定降香中柚皮素和異甘草素含量的方法，該方法線性關系及重現(xiàn)性良好，方法穩(wěn)定準確，操作簡便。【參考文獻】 1國家藥典委員會.中國藥典，部S.北京：化學工業(yè)出版社，2005:158.2郭麗冰，王蕾.降香中黃酮類化學成分研究J.中草藥，2008，39(8):1147. 10-08-22 14:04:00 編輯：studa202.3.5 穩(wěn)定性考察精密吸取降香供試品溶液5 l，在0，1，3，6，12 h，按“2.3.1”項下色譜條件測定柚皮素和異甘草素的峰面積，分別以柚皮素和異甘草素工作

11、曲線計算。柚皮素的測定結果為 =4.668 g，RSD=0.47%(n=5)，提示樣品中柚皮素含量在12 h內穩(wěn)定。異甘草素測定結果為 =7.092 g，RSD=1.01%(n=5)，提示樣品中異甘草素含量在12 h內穩(wěn)定。結果見表4。表4 柚皮素和異甘草素穩(wěn)定性考察（略）2.3.6 重復性考察取同一號樣品5份，按供試品溶液制備方法平行處理，依法測定，求得RSD為1.43%。說明該方法重復性良好。2.3.7 各樣品的含量測定精密吸取樣品溶液10 l，按“2.3.1”項下色譜條件測定柚皮素的峰面積，以柚皮素的工作曲線計算各樣品中的柚皮素含量，同樣測定異甘草素的峰面積，以異甘草素的工作曲線計算各樣

12、品中的異甘草素含量。結果見表5。表5 各樣品中柚皮素和異甘草素含量（略） 本實驗對11個市售降香藥材的分析表明，降香中的柚皮素含量在2.5855.429 mg/g之間，異甘草素含量在7.52628.329 mg/g之間。 降香樣品（以樣品1為例）在372 nm和290 nm下的HPLC圖譜見圖12。3 討論 降香中含有多種黃酮類成分。其中，本實驗已分離出的柚皮素和異甘草素含量較大且其藥理活性與降香藥材的藥理作用相似，故選用這兩種化合物為指標測定含量，為降香的質量控制奠定理論基礎。 通過正交設計實驗對提取總黃酮的次數(shù)、時間、溫度和乙醇濃度進行了考察，確定了本文的提取方法。 本實驗選用的兩種對照品異甘草素和柚皮素經(jīng)紫外掃描分別在290 nm和372 nm處有最大吸收。使用PDA檢測器，得到200400 nm范圍內的全波長圖譜，分別選取290 nm和372 nm下的HPLC分離得到的紫外吸收圖譜，建立各自的工作曲線，并測定相應波長下的峰面積從而定量。 選擇流速1.0 ml/min，調整甲醇、水的比例，發(fā)現(xiàn)當兩者比例為64時分離較好，但是峰形不夠好。所以在流動相中加入一定比例的磷酸，當流動相為甲醇-0.2%磷酸水(6040)時，異甘草素和柚皮素的峰均能較好的與其他峰實現(xiàn)分離。 實驗表明降香藥材中的異甘草素含量高于柚