蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較

1、第卷第期年月蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較郭穎娜，孫（華北制藥股份有限公司，河北摘衛(wèi)石家莊）存在和進(jìn)化都密切相關(guān)，蛋白質(zhì)含量測(cè)定涉及到生產(chǎn)和科研的眾多領(lǐng)域。目前常用的方法有要蛋白質(zhì)與生命的起源、凱氏定氮法、雙縮脲法（）、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法（）。本文總結(jié)各種方法的特點(diǎn)及適用條件，針對(duì)不同的待測(cè)樣品以及對(duì)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的要求不同，我們可以采用不同的方法來(lái)測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)；凱氏定氮法；雙縮脲法；紫外吸收法；考馬斯亮藍(lán)法中圖分類號(hào)文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼文章編號(hào)（）蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法（）、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法（）

2、。其中法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏倍，比法靈敏倍以上。凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。這種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質(zhì)的性質(zhì)；溶液中存在的干擾物質(zhì)；測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。凱氏定氮法原理凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定個(gè)過(guò)程。其原理是樣品中含氮有機(jī)化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化，含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨，氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨，氨用過(guò)量的硼酸溶液吸收，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。特點(diǎn)

3、凱氏定氮法是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法，是測(cè)定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡(jiǎn)單的方法之一，被國(guó)際國(guó)內(nèi)作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法樣品的最佳消化條件為硫酸銅，硫酸鉀，濃硫酸；硫酸銅的用量為影響消化時(shí)間的主要因素，硫酸鉀和濃硫酸用量為第二和第三主要因素；用此最佳條件做實(shí)驗(yàn)，消化時(shí)間僅為收稿日期作者簡(jiǎn)介郭穎娜（），女，助理工程師，從事質(zhì)檢工作。；與其他硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸用量方法對(duì)比，該法所需消化時(shí)間最短，試劑用量減少，可降低實(shí)驗(yàn)成本，也降低了對(duì)環(huán)境的污染。凱氏定氮法適用范圍廣泛，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，試劑消耗量大。若采用模塊式消化爐代替?zhèn)鹘y(tǒng)的消化裝置，可同時(shí)測(cè)定幾份樣

4、品，節(jié)省時(shí)間，提高了工作效率，適用于批量蛋白質(zhì)的測(cè)定，具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。雙縮脲法（）原理雙縮脲（）是兩個(gè)分子脲經(jīng)左右加熱，放出個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能夠以個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。特點(diǎn)雙縮脲法中樣品的取用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性有顯著影響，采用樣品，雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測(cè)精度。雙縮脲法對(duì)不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，不受溫度的影響?？煽焖贉y(cè)定蛋白質(zhì)含量

5、，試劑單一，方法簡(jiǎn)便，但靈敏度差，測(cè)定范圍為蛋白質(zhì)。適用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定，常用于谷物蛋白質(zhì)含量測(cè)定。紫外吸收法原理蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性第期郭穎娜孫衛(wèi)：蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較質(zhì)，吸收峰在處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。特點(diǎn)最常用的紫外吸收法是的光吸收法，含有核酸的蛋白質(zhì)溶液使用和的吸收差法較好。蛋白質(zhì)的稀溶液采用與的吸收差法。紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消

6、耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定，測(cè)定后仍能回收使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。缺點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)較多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差，故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸在紫外區(qū)也有強(qiáng)吸收，但通過(guò)校正可以消除。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因的改變而

7、有變化，因此要注意溶液的值，測(cè)定樣品時(shí)的要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的相一致。考馬斯亮藍(lán)法（）原理法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的?？捡R斯亮藍(lán)是一種有機(jī)染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，其最大吸收波長(zhǎng)從變?yōu)?，蛋白質(zhì)在范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)色素結(jié)合物在波長(zhǎng)下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。特點(diǎn)考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速而穩(wěn)定，左右即達(dá)到平衡，其結(jié)合物室溫下內(nèi)保持穩(wěn)定，且在之間，顏色的穩(wěn)定性最好。該法方法簡(jiǎn)便，易于操作，所用試劑較少，顯色劑易于配制。干擾物質(zhì)少，如糖、緩沖液、還原劑和絡(luò)合劑等均不影響顯色。此法

8、的缺點(diǎn)是由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。該方法適用于要求靈敏度高、快速定量測(cè)定微量蛋白質(zhì)的測(cè)定。結(jié)語(yǔ)種蛋白質(zhì)測(cè)定方法比較如表所示。表方法靈敏度蛋白質(zhì)測(cè)定方法的比較時(shí)間原理說(shuō)明量的準(zhǔn)確測(cè)定；干凱氏定靈敏度低，適用于氮法費(fèi)時(shí)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為氮，用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含用酸吸收后滴定。擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)。用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋紫色絡(luò)合物。白質(zhì)顯色相似。雙縮靈敏度低，適用于中速，脲法多肽鍵堿性紫外吸較為靈敏，收法用于層析柱流出和色氨酸殘基在液的檢測(cè)；核酸的處的光吸收。吸收可以校正。最好的方法；干擾物質(zhì)白質(zhì)結(jié)合時(shí)，由少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺變?yōu)?。隨蛋白質(zhì)不同而變化?？焖?，蛋白質(zhì)中的酪氨酸考馬斯靈敏度最高，亮籃法快速，考馬斯亮藍(lán)染料與蛋參，（）：考文獻(xiàn)李寧幾種蛋白質(zhì)測(cè)定方法的比較山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，李存富關(guān)于蛋白質(zhì)測(cè)定中幾個(gè)問(wèn)