HPLC法測(cè)定油茶籽多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布及氨基酸組成

1、收稿日期:20100420作者簡(jiǎn)介:丁丹華(1984,女,碩士研究生,主要從事油脂及植物蛋白方面的研究工作(E-mailddhwebmailhzaueducn。通訊作者:何東平,教授。要特點(diǎn)是肽回收率很高,同時(shí)分辨率高于離子交換色譜和疏水作用色譜。本試驗(yàn)主要采用HPLC 來測(cè)定油茶籽多肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布及其氨基酸組成。1材料與方法11材料、試劑油茶籽粕由實(shí)驗(yàn)室自制,原料經(jīng)冷榨、低溫浸提工藝脫脂處理。三氯乙酸、甲醛、乙腈、三氟乙酸均為色譜純。相對(duì)分子質(zhì)量參照物:細(xì)胞色素C(M r= 12500,桿菌酶(Mr=1450,乙氨酸乙氨酸酪氨酸精氨酸(M r=451,乙氨酸乙氨酸乙氨酸(M r=189

2、購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?2儀器、設(shè)備AB204E型分析天平,LD510型離心機(jī), PHS25數(shù)顯pH計(jì),Freezone6冷凍干燥機(jī),LM125型超濾試驗(yàn)裝置,Waters600高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司,配2487紫外檢測(cè)器、Empower 工作站和GPC軟件,中空纖維超濾膜(切割相對(duì)分子質(zhì)量M r=3000。13試驗(yàn)方法131油茶籽多肽的制備制備的工藝流程為:油茶籽粕粉碎堿提離心(3000r/min, 20min上清液酸沉離心(3000r/min, 20min沉淀冷凍干燥油茶籽蛋白粉碎過篩(80目懸浮液(3%熱處理(90,20 min調(diào)pH酶解(中性

3、蛋白酶滅酶離心(4000r/min,15min上清液樹脂脫鹽離心上清液冷凍干燥油茶籽多肽超濾透過液冷凍干燥油茶籽多肽132油茶籽多肽水解度(DH的測(cè)定pHStat 法7。DH=c(NaOHV(NaOH/(mhtot100%式中:c(NaOH酶解過程中所加堿液的濃度, mol/L;V(NaOH酶解過程中所加堿液的體積,mL;m底物蛋白質(zhì)的質(zhì)量,g;氨基的平均解離度,在具體的pH和溫度下按=10pHpK/(1+10pHpK(pH為水解溶液的pH,pK可近似取70計(jì)算;h tot 底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù),mmol/g。133平均肽鏈長(zhǎng)度(PCL與平均相對(duì)分子質(zhì)量(Mr的測(cè)定8按下式計(jì)算:PCL=1/D

4、H,Mr=110PCL+18134油茶籽多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定1341測(cè)定條件采用Waters600高效液相色譜儀,對(duì)油茶籽多肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定。色譜柱:TSKgel2000SW XL300mm78mm;流動(dòng)相:V(乙腈V(水V(三氟乙酸=45550.1;檢測(cè)波長(zhǎng):UV220nm;流速:05mL/min;柱溫:30;進(jìn)樣量:10L。1342樣品處理吸取樣品溶液2mL于10mL容量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,經(jīng)微孔過濾膜過濾后測(cè)試。135油茶籽多肽氨基酸組成測(cè)定采用Waters600高效液相色譜儀(配2487紫外檢測(cè)器和Breeze工作站。色譜柱:AccQTag氨基酸柱(39mm15c

5、m;流動(dòng)相A:AccQTag Eluent A;流動(dòng)相B:V(乙腈V(水=6040;檢測(cè)波長(zhǎng):UV248nm;流速:0.5mL/min;柱溫:30;進(jìn)樣量:10L;保留時(shí)間:45min。2結(jié)果與分析21油茶籽多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布211超濾前油茶籽多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布圖1是以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),保留時(shí)間為橫坐標(biāo)的lg M r遷移率圖,即相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為:lg M r=6660211t(r=0999240,r2=0998481 。 /%500010917 140171085000 300014017 151671123000 200015167 160672

6、672000 100016067 1761711421000 50017617 191503572500 18019150 21450467318021450 22017128212超濾后油茶籽多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布(見圖3、表2 /%300014150 151670073000 200015167 160670212000 100016067 176172191000 50017617 191503225500 18019150 21450626518021450 22067264由圖3和表2可以看出,經(jīng)切割相對(duì)分子質(zhì)量3000的超濾膜超濾后,相對(duì)分子質(zhì)量大于5000的大分子肽已經(jīng)不存在,大于

7、3000的肽所占比例極小,證明超濾膜截留是可靠有效的。相對(duì)分子質(zhì)量小于1000的小分子肽所占比例大幅度提高,上升到9754%。經(jīng)計(jì)算肽鏈的平均長(zhǎng)度為81,平均相對(duì)分子質(zhì)量為9051。研究表明,小分子肽易被人體吸收,而且具有很多生理活性功能,如抗氧化、降血脂、降血壓等。因此,對(duì)多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定為進(jìn)一步對(duì)肽活性部分進(jìn)行分離和鑒定打下了良好的基礎(chǔ)。22油茶籽蛋白和多肽氨基酸組成分析(見表3表3油茶籽蛋白和多肽氨基酸組成及含量g /100g氨基酸油茶籽蛋白油茶籽多肽超濾前超濾后天冬氨酸444358276蘇氨酸162258251絲氨酸196098095谷氨酸9671376831脯氨酸17613

8、4108甘氨酸200168124丙氨酸240194098纈氨酸170231078蛋氨酸142121163異亮氨酸184191200亮氨酸328238146酪氨酸134168104苯丙氨酸224156412組氨酸083074181賴氨酸178267329精氨酸510837628由表3可知,經(jīng)中性蛋白酶酶解制備的油茶籽多肽及超濾后的油茶籽多肽的氨基酸組成同油茶籽蛋白的氨基酸組成相比沒有發(fā)生改變,但各氨基酸含量改變不盡相同。其中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和精氨酸是主要組成氨基酸,超濾前油茶籽多肽的蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和賴氨酸含量與油茶籽蛋白相比略有增加但差異不大;谷氨酸、精氨酸含量則有較大提高。研

9、究發(fā)現(xiàn),除肽相對(duì)分子質(zhì)量大小外,多肽的氨基酸組成及氨基酸排序也是影響多肽生物活性的重要因素。3結(jié)論本試驗(yàn)利用高效液相色譜法對(duì)油茶籽多肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布及氨基酸的組成進(jìn)行了分析。得出油茶籽多肽的相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在3000以下,其中相對(duì)分子質(zhì)量1000以下所占比例最大,達(dá)到8373%,肽鏈的平均長(zhǎng)度為8.4,平均相對(duì)分子質(zhì)量為9423。經(jīng)切割相對(duì)分子質(zhì)量3000的膜超濾后,相對(duì)分子質(zhì)量小于1000的小分子肽所占的比率大幅度提高,上升到9754%。肽鏈的平均長(zhǎng)度為81,平均相對(duì)分子質(zhì)量為9051。與油茶籽蛋白相比,超濾前后油茶籽多肽大部分氨基酸組成和含量無明顯差異。7CHINA OILS AN

10、D FATS 2010Vol.35No.11櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂參考文獻(xiàn):1陳欽,鄭清芳油茶餅綜合利用的研究J福建林學(xué)院學(xué)報(bào),2000,20(2:971002黎先勝我國(guó)油茶資源的開發(fā)利用研究J湖南科技學(xué)院學(xué)報(bào),2005,26(11:1271293龔吉軍,李忠海,鐘海雁,等茶籽多肽的制備及抗氧化活性研究J食品研究與開發(fā),2007,28(10:59614吳謀成功能食品研究與應(yīng)用M北京:化學(xué)工業(yè)出版社,20045紀(jì)建國(guó),葉蘊(yùn)華,邢其毅植物多肽類化合物研究進(jìn)展J天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1998,10(3:80866張偉,孫智達(dá),徐志宏花生多肽的制備及生理功能評(píng)價(jià)的研究進(jìn)展J中國(guó)油脂,2007,32(1:74767ADLERNISSEN JEnzymic hydrolysis of food proteinsMLondon:Elsevier Applied Science Publishers,19868張宇昊,王強(qiáng)