血漿長鏈非編碼RNAH19在原發(fā)性肝癌診斷中的價值

1、 2臨床檢驗血漿長鏈非編碼RNA H19在原發(fā)性肝癌診斷中的價值孫一奎，趙楓，王峰，王衛(wèi)華亍波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，浙江亍波315020摘要：目的 探討血漿長鏈非編碼RNA印跡母系表達轉(zhuǎn)錄體（H19）在原發(fā)性肝primary hepatic carcinoma, PHC ）中 的臨床診斷意義。方法 收集并檢測180例PHC患者和211例非肝癌患者血漿中HI9、甲胎蛋白（AFP）、谷氨酰皋 轉(zhuǎn)氨酶2（7-GT2）、異常凝血酶原（AP）巖藻糖昔酶（AFU）和堿性磷酸酶-1 （ ALP - 1）的表達水平,Logistic回0和受試左工作（R（）C）曲線分析其待界性、靈敏度等指標。結(jié)果H19在P

2、HC患&血漿中的農(nóng)達水平明顯升高差 異有統(tǒng)計學意義（P <0.01） ；H19的AUG值為0. 868,約登指數(shù)為0 702 .HI9相對表達水平臨界閾值設(shè)定為0. 073時, 診斷靈敏度為力.78% 特異度為92.42% ；H19+ AFP的AUC為0.949.靈敏度為86. 11%，特異度為92.42%，約登指 數(shù)為0.753,其約登指數(shù)最島；H19 + AFP + 7-GT2聯(lián)合檢測時,AUC可達0.961,靈敏度為91.67%,特異度為91.00%, 約登指數(shù)為0.827（,結(jié)論 H19在PHC患者中衣達水平明顯升高并町作為PHC臨床診斷的獨立標，忐物；H19 + AEP

3、 + y -G12聯(lián)合檢測具有較好的診斷效能。關(guān)鍵詞：肝癌；印跡母系表達轉(zhuǎn)錄體；甲胎蛋白；號谷氨酰愿轉(zhuǎn)氨晦2；異常凝血酶原；a-L-巖藻脈昔酶；堿性確破 嗨-1;受試者工作曲線中圖分類號：R735.7文獻標識碼：A 文章編號：10048685（2016）03 - -03Diagnostic value of long non coding RNA H19 in primary hepatic carcinomaSUN Yi -kui, ZHYAO Feng, WANG Feng, WANG Wei - huaClinical laboratory f Affiliated Hospital o

4、f Medical College of Ningbo ( niversity t Ningbo, Zhejiang 315020, China Abstract: Objective To explore the clinical diagnostic value of imprinted maternally expressed transcript - long non coding RNA H19( IncRNA 1119) in serum of primary hepatic carcinoma( PHC). Methods Serum from 18() PHC cases an

5、d 211 non PHC control cases were collected and detected for the levels of H191 AFP. y - GT2f APt AFP and ALP - I. The sensitivity9 specificity, and other related indexes of them were analyzed by logistic regression and ROC curves Results Thu serum H19 expression in PHC patients were significantly el

6、evated than that in the non PHC cases t and the diflerence was statistically signif- icant ( P <0.01) ； the area under the ROC curve (AUC) of H19 was 0. 868, Youden index was 0. 702. When the cutoff point of H19 was set al 0.073. the sensitivity was 77.78% and the spH ificity was 92. 42% When the

7、 AUC of combination H19 xilh AFP was 0. 949, the sensitivity was 86. 11%, and the specificity was 92. 42% , Youden index was the highest as 0. 753. When the AUC of the combined detection of H19, AFP and y - GT2 was up to 0. 961 9 the sensitivity was 91.67% , the sp<n i- ficity was 91.00% . and Yo

8、uden index was 0. 8266. Conclusion The expression of H19 in serum of PHC patients were significantly ek?vat(?d, and may lie viev<(l as an in(le|Mfen(lent diagnostic! tuinor marker of PHC The diagnosticof the conibined detection of H19, AFP and y - GT2 has preieralile diagnostic value in PHC.Key W

9、ords： Primary hepatic carcinoma； H19； AFP； 7 - (7r2； Almormal prothrombin； Alpha - fucosidase； ALP - I ；ROC curve 2 2原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma, PHC）為 我國常見惡性腫瘤之一,其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫 瘤中居第3位僅次于胃癌和食管癌）冃前臨床上常 規(guī)物理診斷手段（B超、CT、X線肝血管造影）很難發(fā) 現(xiàn)直徑< 1 cm的腫瘤，而傳統(tǒng)的腫瘤標志物的特異性 和靈敏度也不夠奇，差異也很大，不能達到真正意義 上的早期診斷O長鏈非編碼RNA （

10、 long noncoding RNA, IncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄長度超過200 nt并不編碼基金項目：浙江省寧波市自然科學基金項IK2015A610237）作者簡介：孫一奎（1981），男本科，主管檢驗師主婆從事臨床 醫(yī)學檢驗工作。蛋口的RNA分子，近幾年才被關(guān)注并逐漸成為研究 熱點，_2o IncRNA印跡母系表達轉(zhuǎn)錄體（H19）在 PHC中異常表達，可能會成為新熨的持異性和靈敏度 更髙的腫榴標志物，為疾病的早日診斷提供依據(jù)。 因此，尋找敏感性更高、特異性更好、與腫瘤的療效和 預后相關(guān)性等方面更理想的腫瘤標志物，具有十分積 極的意義。本研究收集并檢測180例PHC患者和 211例非肝癌患者

11、血漿中H19、甲胎蛋白（AFP） - 谷氨酰基轉(zhuǎn)氨酶2（y-GT2）、異常凝血酶原（AP）、 a-L-巖藻糖昔酶（AFU ）和堿性磷酸酶- 1 （ ALP - 1）的表達水平，探討血漿長鏈非編碼RNA H19在PHC中的臨床診斷意義。1資料與方法11資料180例PHC患者及211例非肝癌患者血 漿,均來自2014年1月-2015年6月寧波大學醫(yī)學 院附屬醫(yī)院門診及住院患者，所有研究對象均知情同 意，診斷標準均根據(jù)中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范第 二分冊中PHC診斷標準，并經(jīng)術(shù)后病理證實為 PHC01.2 儀器與試劑 OLYMPUSAU640全自動生化分 析儀（OLYMPUS OPTICAL Co.

12、, Ltd. ） ；AB17900 熒光 儀（廣東華運儀牛物工程有限公司）。AFP試劑 盒（批號：523631）；y_GT2、AP、ALP 和 AFU 試劑盒 （批號：20150601 ）；RNA提取試劑（批號:10296 - 028）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeS<ript® RT）；熒光 PCR Mix（批號：4304437 ）o13方法AFP采用電化學發(fā)光免疫法，使用儀器 為羅氏E2010電化學發(fā)光分析儀。y-（；T2、AP、 ALP - 1和AFU采用酶速率法。陽性判斷標準: AFP400-GT2M64 U/L, ALP -1120 U/L,AFU>35 U/L,A

13、Pm200 U/L。血漿中 1119 和甘油醛- 3-磷酸脫氫酶（GAPDH）內(nèi)參基因的表達水平，采用 TaqMan實時逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR方法，在ABI7900熒光 PCR 儀上檢測。使用 Primer - Blast 和 Primer Express 3.0軟件設(shè)計引物及探針（表1 ），所有核昔酸均在ln- vitrogen公司合成）表1引物序列引物名稱引物序列（5，-3，）退火溫度（七）產(chǎn)物長度（bp）H19-FGACTCAGGAATCGGCTCTGG593081119-RACAGAGTCGTGGAGGCTTTG-FACCACAGTCC.KTGCCATCAC59452GAPhHTCCACCA

14、CCCTGTTGCTGTA注:F衷示上游引物;R農(nóng)示下游引物1.4 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 16. 0 .GraphPad PRISM 5.0和MedCalc software 11.5.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分 析。非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗比較組間血漿H19水 平;逐步回歸變量篩選和Logistic回歸對H19進行多 變量分析;ROC曲線評價H19、AFP、AP、AFU、ALP-1 和了-GT2診斷PHC敏感度和特異度使用ROC曲 線下面積（AUC）比較各指標的診斷能力；根據(jù)PHC 中的ROC曲線確定診斷臨界值（cut -off值）；以95% 為可信區(qū)間,P<（）.（）5為差異具

15、有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1 血漿中H19及常見腫瘤標志物表達水平 PHC 患者血漿樣本中，H19、AFP、AFU、ALP-1、AP及丫 - CT2的表達水平高于非肝癌患者，差異冇統(tǒng)計學意義 （P<0.01）（表 2）。 2 2表2 PHC患者與非肝癌患者的血漿1119及當見腫瘤標志物表達水平中位數(shù)（P25.P75）組別例數(shù)（例）1119AFP( pLg/L)AFU(U/L)AIT - 1 ( U/L)PHC患者1800.11(0.08,0.15)572.56(302.76,1096.73)36.46(26.70,50.86)146.68( 1(651.229. 19)非肝癌患者2110.

16、04(0.03,0.05)58.20(30.94,148. 14)18.57(15.05,25. 16)87.04(57.80,110.70)P值<0.01<0.01<0.01<0.01 2 2續(xù)表組別例數(shù)（例）AP( U/L)7-GT2(U/L)PHC患者180247.32(164.40 310.88)70.20(44.56.89.98)罪肝癌患者21196.28(57.03,142.86)33.71(21.74,49.15)P值<0.01<0.012.2 H19與其他常用PHC標志物單項檢測的ROC分析 H19、AFU的AUC值分別為0.868.0.81

17、9,約 登指數(shù)分別為0.702、0.566,AFP與H19的AUC及約 登指數(shù)較大且兩者相近。當H19相對表達水平臨界 閾值設(shè)定為0.073時,診斷靈敏度為77.78%,特異度 為92.42% （表3）。H19相對表達水平在0.073以上 診斷為PHC。表3 1119與人他常用PHC標志物"I頁檢測的ROC分析標怎物AUC靈敏度（）特異度（）約登指數(shù)11190.86877.7892.420.702AFP0.92696.6777.250.739AFU0.81981.6774.880.566ALP-10.82766.6789.570.562AP0. 82782.7877.730.6057

18、 - GT20. 84267.7884.830.5262.3 H19與其他常用PHC標志物的Logistics分析及聯(lián)合檢測的ROC分析 逐步logistic回歸分析預測 變址的ROC曲線分析檢測刪除了 AFU和APO H19 + AFP的AUC為0.949,靈敏度為86. 11%,特異 度為 92.42%,約登指數(shù)為 0.785。H19 + AFP + 7 -3GT2的聯(lián)合檢測診斷符合率較高，其AUC、靈敏度、特 異度、約登指數(shù)分別為0. 961.91. 67% .91. 00%、 0. 827 ；而1119 + AFP十ALP - 1聯(lián)合診斷效能要比 H19 + AFP + ALP - 1

19、 + 7 - (VV2聯(lián)合診斷效能更高,差 異有統(tǒng)計學意義(/*0.01)(表4)。表4 H19和AFP聯(lián)合其他常用PHC的ROC分析標吉物AIC靈敏度(%)持異度(%)約譙指數(shù)H19 + AEP0.94986. 1192.420.785H19 + ALP-10.9048L 1191.000.721Hi9+7-GT20.91576. 1196.210.723AFP + ALP - 10.94594.4480.570.750AFP + 丫 - GT20.95289.4486.260.7571119 +AFP+ V-GT20.96191.6791. (X)0.8271119 + AEP + ALP

20、 - 10.95388.8989.570.785H19 + AEP+ ALP - 1 + 7 - GT20.96389.4492.420.8193討論非編碼RNA依據(jù)長度可以分為兩大類：短片段 非編碼RAN(包括siRNA、miRNA、piRNA)和長片段 非編碼RNA(lncRNA),0前的研究主要集中于短片 段 ncRNA，女口 microR 2NA 和 siRNAl4_5,并已有關(guān)于 多種動植物基因組中microR 2NA的研究報道， 盡管如此，當前對于長片段neKNA的報道也越來 越多0 IncKNA并不編碼蛋白，而是以BNA的形式在 表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后水平等多種層面上廣泛參 與

21、基因表達凋控，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并且與腫瘤 段襲、轉(zhuǎn)移及患者預后密切相關(guān)。深入研究IncKNA 與腫瘤發(fā)病的關(guān)系有望為腫瘤的預防和診治提供全 新的思路：，2-，31oH19是第一個被發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)IncRNA ,4,在 進化上具有高度的保守性。人出生后大多數(shù)組織的 表達趨于停止，僅在骨骼肌和心肌有一定的表達，而 當機體組織再生或形成腫瘤時可被重新激活。據(jù)報 道 ，H19在胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌及膀胱癌等中 異常表達,發(fā)揮促癌作用。兒訕等研究發(fā)現(xiàn)兇，不但 在血漿中檢測到H19,并且通過實驗證實血漿中的 H19穩(wěn)定存在,適合作為常規(guī)檢測。本研究檢測血漿 中的IncRNA H19,在180例PHC

22、患者血漿中進一步 證實了其高表達，說明H19在PHC中具有潛在的診 斷意義。臨床上以AFP為基礎(chǔ)的常用PHC的腫瘤標志物 AFU、ALP-1、AP和7-GT2在臨床診斷時，都存在 著不同程度的假陽性率或靈敏度不高的缺陷，因此, 為提高PHC的診斷敏感性，腫瘤標志物聯(lián)合診斷通 常能夠更有效地篩選和診斷腫瘤本研究結(jié)果顯示, 在檢測單指標時，相對于其他PHC標志物，H19與 AFP的AUC及約登指數(shù)最大且兩者相近，都具有較 高的診斷靈敏度和特異度，1119的診斷能力與ALP - 1 和了 -(；T2無差異，但其靈敏度和持異度都比ALP - 1 和-GT2髙，同時H19與AFU、AP相比，差異具有 統(tǒng)

23、計學意義。因此，與AFP.ALP-1和Y-GT2類似, PHC患者血漿中游離H19的表達水平檢測，可作為 PHC診斷的冇用指標。通H Logistics分析后，本研究表明H19 + AFP + 丫 -GT2聯(lián)合檢測診斷效能優(yōu)于各單項或雙項指標檢 測的診斷效能，且與以H19 + AFP為皐礎(chǔ)的聯(lián)合應用 ALP - 1或/和7 - GT2診斷能力相近，但H19 + AFP + 7-GT2聯(lián)合檢測約登指數(shù)最大，說明H19 + AFP + 了 - GT2的聯(lián)合檢測對提高PHC的敏感性和準 確率具有更髙的診斷價值。綜上所述，H19可做為診斷PHC獨立有冃的腫 瘤標志物，但H19及現(xiàn)有臨床常用PHC血漿腫

24、瘤標 志物各指標單獨應用診斷PHC都有一定局限性, H19 + AFP + 7-GT2聯(lián)合檢測具有較好的互補作用, 可以顯著提髙PHC診斷的靈敏度和持異度，減少漏 診率，因此，以血循環(huán)H19水平升高為基礎(chǔ)的聯(lián)合分 析為PHC提供了更準確的診斷方法。參考文獻1 Qi Pw Du X. The long non coding RNAst a new cancer diagnostic and lh<kra|MMitic gold mine J. Mcxl Patholt 2013, 26(2)： 155 - 1652 李琪兒.LNC RNA：腫痞分子診斷中的一顆新星J中國生物 化學與分子生物

25、學報.2O14(3);233 -24O.3 Zhang L. Yang F. Yuan JHv </ al. Epigenetic activati<ni of the MiK - 200 family contnbutes to H19 一 merliated metastasis suppression in hepat(M?ellular can inoina J Ciiwiiiof nesk. 2013 , 34 (3)： 577-586.4 WASSAKMAN KM.ZHANGA.ST ORA G.rf al. S mall RANs in Escliezrichia c

26、oli J Trends Microbiol 11999 .7(1) ：37 -455 MASSE E.MAJDALAN1N.G OTTES MAN S. Regulatory roles for small KA Ns in bacteri a J . Curropin M icrol)iol .200316(2): 120 124.6 VIT AM P. ROY OH. SEITZ Ht et al. Identification of 13 novel liuinaiMnodiiication guide RNAs J 、ucki(: Acids Kesean h. 20031 31：

27、6543 -6551 7 QU L Hf MENG Q. ZHOU H. et al. Identification of 10 novel sn- oRNAgpne clustere from Arabidopsis lhaliana J . Nucleic: Acids Research. 2(X)1 .29： 1623 -16308 BROWN J W.CLARK G 1IJ：ADER D J. et al. MultiplesnoKNA geneclustei from Arabidopsis J RNA ,200117:1817 - 18329 CHEN C LJJ ANCD, ZH

28、OU II. w o/. Hu- highofNAs inplants： identificalion and comparative study of 120 snoKNA genes fromOryza saliva f J Nucleic Acids Research, 2003.31 ： 2601 -2613 10 ZHOU IL ZHAO J, Y U C H, et al. Identification of a novel Im>x C/I) sn 2oRNA from mouse nucleolar cDNA library J . Gene. 2004.327:99-105 11 K APKANOV P. CHENG J,DIKE St et al. RNA maps rweal new RNAclasses and a possible function for pervasive transcription J Science. 2007 J16： 1484