細(xì)胞活體染色技術(shù)

1、2實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)細(xì)胞活體染色的方法。 觀察動、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體，液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布。3細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)4實驗原理 一般的生物材料不能穿透細(xì)胞膜，一般的生物材料不能穿透細(xì)胞膜，只有當(dāng)細(xì)胞被固定后，細(xì)胞膜被破只有當(dāng)細(xì)胞被固定后，細(xì)胞膜被破壞，染料才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。但是，壞，染料才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。但是，有一些染料（稱有一些染料（稱“活體染料活體染料”）卻）卻能進(jìn)入活細(xì)胞，它們是一些無毒或能進(jìn)入活細(xì)胞，它們是一些無毒或毒性很小的染色劑，能使細(xì)胞中某毒性很小的染色劑，能使細(xì)胞中某些特定結(jié)構(gòu)著色?；铙w染料基本上些特定結(jié)構(gòu)著色?；铙w染料基本上不影響或很少影響細(xì)胞的生命活動。不影響或很少影響細(xì)胞的

2、生命活動。5 活染法彌補(bǔ)了活觀察法不能顯示細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)的活染法彌補(bǔ)了活觀察法不能顯示細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)的不足，也避免了固定染色法對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破環(huán)和不足，也避免了固定染色法對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破環(huán)和造成人為假象的弊病。遺憾的是，適宜活體染色造成人為假象的弊病。遺憾的是，適宜活體染色的染料較少，能顯示出的結(jié)構(gòu)和種類也不多。的染料較少，能顯示出的結(jié)構(gòu)和種類也不多。 活體染色分為體內(nèi)活染和體外活染兩種。前者是活體染色分為體內(nèi)活染和體外活染兩種。前者是將染料注射于生物體內(nèi)，染色后再取材觀察。后將染料注射于生物體內(nèi)，染色后再取材觀察。后者是取材后，對離體的活細(xì)胞進(jìn)行染色。為保持者是取材后，對離體的活細(xì)胞進(jìn)行染色。為保持

3、離體細(xì)胞的正常存活，染色時需供給細(xì)胞以正常離體細(xì)胞的正常存活，染色時需供給細(xì)胞以正常的溫度，滲透壓，的溫度，滲透壓，PHPH等。等。6活體染色7較為常見的活體染色劑較為常見的活體染色劑 詹納斯綠B(Janus green B) 中性紅 臺盼藍(lán)(trypan blue)8詹納斯綠B(Janus green B) 專一專一用于用于線粒體線粒體的染色。它可以和線的染色。它可以和線粒體中的細(xì)胞色素粒體中的細(xì)胞色素C C氧化酶結(jié)合，保持氧化酶結(jié)合，保持氧化狀態(tài)氧化狀態(tài)( (即有色狀態(tài)即有色狀態(tài)) )呈呈藍(lán)綠色藍(lán)綠色, ,而在而在周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原, ,成為無色成為無色狀態(tài)。

4、狀態(tài)。 必須指出的是，只有具有必須指出的是，只有具有活性的活性的細(xì)胞細(xì)胞色素色素C C氧化酶才能夠把詹納斯綠氧化酶才能夠把詹納斯綠B B氧化，氧化，從而使它顯出顏色從而使它顯出顏色9人口腔上皮細(xì)胞的線粒體分布在實驗過程中在實驗過程中務(wù)必保持所取的務(wù)必保持所取的材料的活性。通材料的活性。通常，需要把生物常，需要把生物材料置于材料置于的冰水浴低的冰水浴低溫中，并且操作溫中，并且操作要迅速。要迅速。1011中性紅中性紅 中性紅是中性紅是液泡系液泡系的特殊的特殊活體活體染色劑，染色劑，它可將不同發(fā)育時期的液泡染成不它可將不同發(fā)育時期的液泡染成不同深度的同深度的紅色紅色，在細(xì)胞處于生活狀，在細(xì)胞處于生活

5、狀態(tài)下細(xì)胞質(zhì)和核不被染色，該染料態(tài)下細(xì)胞質(zhì)和核不被染色，該染料對液泡系具有一定對液泡系具有一定專一性專一性。1213液泡系的中性紅染色點經(jīng)觀察液泡系的中性紅染色點經(jīng)觀察14臺盼藍(lán)(trypan blue) 臺盼藍(lán)：正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能臺盼藍(lán)：正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺盼藍(lán)，使之不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪夠排斥臺盼藍(lán)，使之不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，胞膜的通透失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色。性增加，可被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色。 通常認(rèn)為細(xì)胞膜完整性喪失，即可認(rèn)為細(xì)胞通常認(rèn)為細(xì)胞膜完整性喪失，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡，這與中性紅作用相反。因

6、此，借已經(jīng)死亡，這與中性紅作用相反。因此，借助臺盼藍(lán)染色可以非常簡便、快速地區(qū)分活助臺盼藍(lán)染色可以非常簡便、快速地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。臺盼藍(lán)是組織和細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞和死細(xì)胞。臺盼藍(lán)是組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的死細(xì)胞鑒定染色方法之一。注意凋最常用的死細(xì)胞鑒定染色方法之一。注意凋亡小體也有臺盼藍(lán)拒染現(xiàn)象。亡小體也有臺盼藍(lán)拒染現(xiàn)象。 1516實驗用品l材料：黃豆根尖、洋蔥、小鼠。材料：黃豆根尖、洋蔥、小鼠。l器械：顯微鏡、鑷子、刀片、器械：顯微鏡、鑷子、刀片、剪刀、解剪刀、解剖針、剖針、 表面皿、載玻片、蓋玻片、吸管、表面皿、載玻片、蓋玻片、吸管、收水紙等。收水紙等。l試劑：試劑： Ringer Rin

7、ger氏液氏液 1 130003000中性紅溶液中性紅溶液 1 150005000詹納斯綠詹納斯綠B B 臺盼藍(lán)染色液臺盼藍(lán)染色液 香柏油、二甲苯、蒸餾水等香柏油、二甲苯、蒸餾水等17實驗方法1. 1. 液泡系的中性紅活體染色液泡系的中性紅活體染色取黃豆芽的根尖處的縱切面取黃豆芽的根尖處的縱切面 于載玻片上的中性紅染液中染色于載玻片上的中性紅染液中染色510min510min 吸去染液，滴一滴吸去染液，滴一滴RingerRinger液液 蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢182.線粒體的活體染色 用植物細(xì)胞觀察線粒體的活體染色用植物細(xì)胞觀察線粒體的活體染色撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊撕取洋蔥鱗莖

8、內(nèi)表皮一小塊于載玻片上的于載玻片上的1/5000 Janus green B1/5000 Janus green B染色染色30min30min吸去染液，滴一滴吸去染液，滴一滴RingerRinger液液蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢19娶取鼠肝肝組織一小塊，放入盛有娶取鼠肝肝組織一小塊，放入盛有RingerRinger氏液表氏液表面皿中洗去血液面皿中洗去血液 于載玻片上的于載玻片上的1/5000 Janus green B1/5000 Janus green B染色染色30min30min 撕開組織塊，這樣溶液中會有一些細(xì)胞或細(xì)胞群撕開組織塊，這樣溶液中會有一些細(xì)胞或細(xì)胞群 吸取溶液，

9、放在載玻片的吸取溶液，放在載玻片的RingerRinger氏液中氏液中 墊上兩根短頭發(fā)，蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢墊上兩根短頭發(fā)，蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢 用動物細(xì)胞觀察線粒體的活體染色用動物細(xì)胞觀察線粒體的活體染色為什么要用油鏡觀察，植物細(xì)胞卻不用？為什么要用油鏡觀察，植物細(xì)胞卻不用？為什么要墊上兩根短頭發(fā)？為什么要墊上兩根短頭發(fā)？思考20 3 3. .人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察清潔載玻片放在清潔載玻片放在3737恒溫水浴鍋的金屬板上恒溫水浴鍋的金屬板上滴滴2 2滴滴1/5000 Janus green B1/5000 Janus green B染液染液用

10、牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中染色染色10l5min(10l5min(注意不可使染液干燥，必要時可再注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液加滴染液) )蓋上蓋玻片蓋上蓋玻片, ,顯微鏡下觀察顯微鏡下觀察214. 臺盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞死活取小鼠腹腔水細(xì)胞于潔凈載玻片上滴加1%臺盼藍(lán)1滴蓋上蓋玻片于顯微鏡下進(jìn)行鏡檢22注意事項注意事項 對口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行染色時不可使對口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行染色時不可使染劑干燥，可適當(dāng)補(bǔ)加染液。染劑干燥，可適當(dāng)補(bǔ)加染液。 在對植物進(jìn)行觀察時一定要讓材料在對植物進(jìn)行觀察時一定要讓材料盡量展開。盡量展開。 詹納斯綠詹納斯綠B(Janus green B)B(Janus green B)溶液現(xiàn)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。 試驗中速度要快，以免組織細(xì)胞死試驗中速度要快，以免組織細(xì)胞死亡亡23思考題思考題 所觀察到的液泡大小是否有差別，染所觀察到的液泡大