微生物實(shí)驗(yàn)4 芽孢觀察

1、細(xì)菌的芽孢染色觀察實(shí)驗(yàn)劉欣怡201100140057生命科學(xué)基地班組別：周一下午三組同組者：曹平平，周楠，劉藝，劉希偉實(shí)驗(yàn)時間：2012年10月22號一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)并掌握芽孢染色法2、了解芽孢桿菌的形態(tài)特征3、鞏固顯微鏡操作技術(shù)及無菌操作技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種 枯草芽胞桿菌，梭狀芽胞桿菌。2、溶液和試劑5%孔雀綠水溶液，0.5%番紅水溶液。3、儀器和其他用品 酒精燈，載玻片，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），顯微鏡、吸水紙、擦鏡紙，接種環(huán)，載玻片夾子，無菌水等。三、實(shí)驗(yàn)原理1、芽孢又叫內(nèi)生孢子(endosopre)，是某些細(xì)菌生長到一定階段在菌體內(nèi)形成的休眠體，通常呈圓形或橢圓形。細(xì)菌能否

2、形成芽孢以及芽孢的形狀、芽孢在芽孢囊內(nèi)的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鑒定細(xì)菌的依據(jù)之一。2、芽孢菌體的特點(diǎn)：a.芽孢的含水率低，38%40%。 b.芽孢壁厚而致密，分三層：外層是芽孢外殼，為蛋白質(zhì)性質(zhì)。中層為皮層，由肽聚糖構(gòu)成，含大量2，6-吡啶二羧酸。內(nèi)層為孢子壁，由肽聚糖構(gòu)成，包圍芽孢細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)。芽孢萌發(fā)后孢子壁變?yōu)闋I養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞壁。 c.芽孢中的2，6-吡啶二羧酸（簡稱DPA）含量高，為芽孢干重的5%15%。吡啶二羧酸以鈣鹽的形式存在，鈣含量高。在營養(yǎng)細(xì)胞和不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)2，6-吡啶二羧酸。芽孢形成過程中，2，6-吡啶二羧酸隨即合成，芽孢就具有耐熱性，芽孢萌發(fā)形成營養(yǎng)細(xì)胞時，

3、2，6-吡啶二羧酸就消失，耐熱性就喪失。 d.含有耐熱性酶。 芽孢由于有以上四個特點(diǎn)，使得芽孢對不良環(huán)境如高溫、低溫、干燥、光線和化學(xué)藥物有很強(qiáng)的抵抗力。細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞在7080時10分鐘就死亡，而芽孢在120140還能生存幾小時，營養(yǎng)細(xì)胞在5%苯酚溶液中很快就死亡，芽孢卻能存活15天，芽孢的大多數(shù)酶處于不活動狀態(tài)，代謝活力極低，所以，芽孢是抵抗外界不良環(huán)境的休眠體。3、芽孢染色法是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對染料的親和力不同的原理，用不同染料進(jìn)行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當(dāng)先用弱堿性染料，如孔雀綠或堿性品紅在加熱條件下進(jìn)行染色時，此染料不

4、僅可進(jìn)入菌體，而且也可進(jìn)入芽孢，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出，若再用復(fù)染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。4、芽孢有的長在中央或近中央，圓形或橢圓形，芽孢的大小，位置，在分類鑒定上有一定的意義，它僅僅是芽孢細(xì)菌生活史的一個環(huán)節(jié)。芽孢可作為培養(yǎng)基滅菌徹底與否的檢驗(yàn)依據(jù)、在桿菌中能形成芽孢的種類較多，在球菌和螺旋菌中只有少數(shù)菌種可形成芽孢。5、產(chǎn)生芽孢的幾個屬：芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)，四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容根據(jù)實(shí)驗(yàn)提供的兩種細(xì)菌，即枯草芽孢桿菌和梭狀芽孢桿

5、菌，然選一種或者兩者都選，進(jìn)行制片，進(jìn)而染色觀察細(xì)菌芽孢的形態(tài)特征。若選擇兩種菌，可以再制作在同一個載玻片上。五、實(shí)驗(yàn)步驟1、涂片取一塊洗凈并自然晾干的載玻片，分別滴兩小滴蒸餾水于載玻片靠近中央處；用接種環(huán)無菌操作，先將接種環(huán)在酒精燈上燒2遍，從酒精燈旁用稍冷卻的接種環(huán)從枯草芽孢桿菌牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面或梭狀芽孢桿菌牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面挑取適量菌苔（接觸一或兩下），在載玻片上的兩滴蒸餾水中分別涂抹（接觸三到四下），使菌懸液在載玻片上形成均勻薄膜或觀察到小水滴有些渾濁。記錄兩者相對位置，不要弄混。并且還要記清載玻片真反面，可以做標(biāo)記。2、干燥固定 可以有酒精燈進(jìn)行加熱干燥，用夾子夾住載玻片在火焰

6、上過1到2遍就放到手背上試一下玻片溫度，一不燙手為原則，一直重復(fù)操作直至液滴完全干燥固定。3、染色向干燥固定好的片子上加數(shù)滴孔雀綠染液，使菌完全被覆蓋，用木夾夾住載玻片一端，在微火上加熱（可以在酒精燈上過幾下，稍停一下再在酒精燈上過幾下根據(jù)染液冒蒸汽的實(shí)際情況自行判斷做法）至染料稍冒蒸汽并開始計(jì)時，維持5min。加熱過程中及時補(bǔ)充染液。切勿讓涂片干涸。4、冷卻后水洗染色結(jié)束后，待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗載玻片背面，直至流出的水無色為止。 5、復(fù)染水洗好后，用番紅水覆蓋菌，染色2min 。 6、水洗干燥復(fù)染結(jié)束后，用緩流水洗載玻片背面，直至流出的水無色為止。然后自然風(fēng)干。7、鏡檢將制好的玻片

7、放在顯微鏡下，先低倍鏡，再高倍鏡，最后滴加香柏油用油鏡觀察芽孢形態(tài)，并記錄。8、實(shí)驗(yàn)結(jié)束 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，整理實(shí)驗(yàn)臺，儀器歸位，電器拔下電源，擦凈染液。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及記錄照片1、芽孢染色觀察結(jié)果：顯微鏡視野中，芽孢呈現(xiàn)綠色，菌體呈現(xiàn)淡淡的紅色或者無色透明（番紅水復(fù)染不成功），亦或者視野中僅有幾個番紅水復(fù)染上了紅色的菌。枯草芽孢桿菌芽孢呈橢圓到柱狀，位于菌體中央或末端，菌體基本無大變化；梭狀芽孢桿菌芽胞呈圓形，比菌體粗，位于菌體頂端，使細(xì)菌呈鼓槌狀。綜合來看，視野中，能看到有的菌中間有較亮且染為綠色的部分，即為芽孢。有的芽孢在菌的中間出現(xiàn)，即中生芽孢；有的芽孢在菌的末端出現(xiàn)，即端生芽孢；有的芽孢向外

8、膨脹；有的芽孢不向外膨脹；有的芽孢游離在菌體之外，估計(jì)是操作中動作較大使得芽孢脫落下來。2、芽孢染色觀察記錄圖：該圖為梭狀芽孢桿菌的觀察視野。從圖中可以看到第一次孔雀綠染色較好，但是水洗脫色以及復(fù)染色有點(diǎn)失敗，大部分菌體沒能染上紅色，菌體大部分是綠色或無色。該圖中能看到幾個染色較好的細(xì)菌，菌體為紅色，內(nèi)含綠色的芽孢，為中生芽孢。該圖為枯草芽孢桿菌的觀察視野。圖中可以看到染色較好的綠色芽孢，但是菌體近乎都為無色的，說明水洗脫色較好但是復(fù)染色不成功。對于菌體沒能復(fù)染上紅色，有兩大可能原因：一是番紅水濃度低，二是染色時間不夠。3、全班內(nèi)搜尋好的實(shí)驗(yàn)玻片，進(jìn)一步觀察芽孢的形態(tài)特征本實(shí)驗(yàn)圖片從其他組獲得

9、，觀察視野中可以看到一些復(fù)染色較好、呈紫紅色的菌體，當(dāng)然還有一些菌體是綠色或者無色；芽孢染色較好，被染成了綠色，但是游離的芽孢很多，估計(jì)有較為嚴(yán)重的不當(dāng)操作致使很多芽孢從菌體中脫落下來。4、資料查找圖：與自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比，更進(jìn)一步了解芽孢形態(tài)特征。中生芽孢端生芽孢游離芽孢七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1、本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果：能較為清楚地觀察到芽孢的存在，而且能觀察到不同的芽孢著生方式。觀察到不少的芽孢游離在菌體之外，估計(jì)和自己的操作有較大關(guān)系，分析此現(xiàn)象發(fā)生的原因可能有如下三種：a.由于芽孢較厚，耐壓力細(xì)胞體強(qiáng)，可能由于在圖片時用力過大，將細(xì)胞體的細(xì)胞壁壓碎從而使的芽孢脫落出來； b.可能是由于菌體培養(yǎng)

10、時間過久，芽孢正處于復(fù)蘇階段，所以大多數(shù)芽孢都從菌體中游離出來；c.可能在干燥固定和染色兩個步驟中，加熱的溫度太高使得芽孢從菌體中裂出。芽孢染色較好，均為綠色或淺綠色，但是外面的菌體基本上沒染上番紅水的紅色，但是外面的菌體水洗脫色不錯，在觀察視野中成無色透明狀。沒能復(fù)染上番紅水的紅色的原因可能有：番紅水是番紅染液的稀釋液，濃度小不易使菌體染上色；番紅水復(fù)染的時間較短，不足老師要求的2min；水洗后直接進(jìn)行復(fù)染，或略了載玻片上的殘余水，沒有先用番紅水沖載玻片而是直接覆蓋，使得染液濃度又降低。2、綠色芽孢及紅色菌體的觀察現(xiàn)象分析：由于芽孢壁厚、透性低上不易著色，當(dāng)用番紅、結(jié)晶紫等進(jìn)行單染色時，菌體

11、和芽孢囊著色，而芽孢囊內(nèi)的芽孢不著色或僅顯很淡的顏色，游離的芽孢呈淡紅或淡藍(lán)紫色的圈。但是用著色力強(qiáng)的染色劑孔雀綠，在加熱條件下染色，使染料不僅進(jìn)入菌體也可進(jìn)入芽孢內(nèi)，菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，而芽孢一經(jīng)染色便難以被水洗脫。當(dāng)用對比度大的復(fù)染色劑番紅染色后，芽孢仍保留初染劑孔雀綠的綠色，而菌體和芽孢囊被染成復(fù)染色劑的顏色，使芽孢和菌體更易于區(qū)分。3、要保證本實(shí)驗(yàn)獲得成功，必須要注意以下幾點(diǎn)a.選用適當(dāng)菌齡的菌種，幼齡的尚未形成芽孢，而老齡菌芽孢囊已破裂。b.加熱染色時必須維持在染液微冒蒸汽的狀態(tài)，加熱沸騰會導(dǎo)致菌體或芽孢囊破裂，如熱不夠則難以著色。c.脫色必須等玻片冷卻后進(jìn)行，否則驟然用冷水沖

12、洗會導(dǎo)致玻片破裂。八、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1、加熱時使用載玻片夾子或試管夾，以免燙傷。2、使用染料時一定要注意避免沾到衣物上。3、載玻片一定要洗凈，自然晾干。4、向載玻片上滴加兩滴蒸餾水時一定要注意水滴要小。5、載玻片未干燥固定前，注意水平放置玻片，以防載玻片上的兩滴水滴混合以至于制片失敗。6、供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜。7、制片的干燥固定操作中，注意加熱程度及載玻片溫度，以免加熱溫度太高使得菌和芽孢裂開。8、孔雀綠染色計(jì)時是從加熱覆蓋了染液的載玻片、看到有蒸汽冒出開始的。9、孔雀綠染液染色過程中，需加熱，但是不要一直放在酒精燈火焰上加熱，以防載玻片加熱斷裂，可以在火

13、焰上多過幾下后移開稍稍冷卻。10、孔雀綠染液染色加熱過程要及時補(bǔ)充染液，切勿讓涂片干涸。11、補(bǔ)充染液，需要先將載玻片從酒精燈火焰上移開，等待稍稍冷卻后再向載玻片上滴加孔雀綠染液，以防冷的染液遇到熱的載玻片使得載玻片斷裂。12、本次實(shí)驗(yàn)中，水洗均沖洗載玻片無菌面。13、實(shí)驗(yàn)中，圖片時要動作輕緩，以防因動作太大而使得芽孢從菌體上脫落下來。14、孔雀綠染液染色過程中，要注意不能持久加熱，會使得載玻片溫度很高，溫度很高容易使得芽孢和菌體裂開。15、孔雀綠染液加熱染色后，需要將載玻片冷卻一小段時間后再水洗，以防熱的載玻片突然遇到冷的水流發(fā)生斷裂。16、注意兩次染色的時間。17、番紅水復(fù)染并水洗干凈后，

14、一定要自然晾干載玻片。18、鏡檢時，先低倍鏡，再高倍鏡，最后滴加香柏油換為油鏡。19、實(shí)驗(yàn)后洗干凈手再離開。九、實(shí)驗(yàn)思考題1、用簡單染色法能否觀察到細(xì)菌的芽孢?說明原因。答：不能。細(xì)菌的芽孢具有厚而致密的壁。透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽孢不著色（芽孢呈無色透明狀）。2、為什么芽孢染色需要進(jìn)行加熱？答：芽孢壁厚，透性低，不易著色。加熱條件下染色，染料可以進(jìn)入菌體內(nèi)，也可以進(jìn)入芽孢。3、用孔雀綠初染芽孢后，為什么必須等載玻片冷卻后再用水沖洗？ 答：若玻片不冷卻就直接沖洗，會因?yàn)橥蝗挥隼涠选?、細(xì)菌芽孢用孔雀綠染色并加熱時，為什么不能蒸干染液？答：加熱染色都不能把染料蒸干,

15、染料被蒸干后積聚在玻片以及菌體上,干擾光線穿透影響鏡下觀察菌體結(jié)構(gòu)情況。5、若在視野中多看到游離的芽孢，而很少看到芽孢囊和營養(yǎng)細(xì)胞，試分析原因。 答：a.由于芽孢較厚，耐壓力細(xì)胞體強(qiáng)，可能由于在圖片時用力過大，將細(xì)胞體的細(xì)胞壁壓碎從而使的芽孢脫落出來。 b.可能是由于菌體培養(yǎng)時間過久，芽孢正處于復(fù)蘇階段，所以大多數(shù)芽孢都從菌體中游離出來。干燥固定和染色兩個步驟中，加熱的溫度太高使得芽孢從菌體中裂出。6、本實(shí)驗(yàn)為什么應(yīng)選用適當(dāng)菌齡的菌種？答：幼齡菌種尚未形成芽胞，而老齡菌芽胞囊已破裂。十、實(shí)驗(yàn)小結(jié)總體來看本次試驗(yàn)還是比較順利的。本次試驗(yàn)的不足之處是芽孢染色效果很好，但是菌體染色效果不是很好，偶爾有幾個菌體被染上了紅色或者淡紅色，大部分都是透明的。自我分析菌體沒能復(fù)染上番紅水的紅色的原因可能有：a.番紅水是番紅染液的稀釋液，濃度小不易使菌體染上色；b.番紅水復(fù)染的時間較短，不足老師要求的2min；c.水洗后直接進(jìn)行復(fù)染，或略了載玻片上的殘余水，沒有先用番紅水沖載玻片而是直接覆蓋，使得染液濃度又降低。除去這點(diǎn)不足，