UCSC 操作步驟

1、查詢啟動(dòng)子的更多方法：1. UCSC（1）網(wǎng)址：/cgi-bin/hgNear在Genome里選擇物種，比如human，search里輸入你的基因名PTEN，點(diǎn)擊Go（2）出現(xiàn)新的頁(yè)面，看到“Known Gene Names”下面的PTEN了吧，點(diǎn)它（3）又回到了和（1）類似的頁(yè)面，此時(shí)，點(diǎn)擊sequence（4）出現(xiàn)一個(gè)新的頁(yè)面，選中promoter，同時(shí)可以輸入數(shù)值修改具體的序列區(qū)域，比如Promoter including 2000 bases upstream and 100 downstream，即表示啟動(dòng)子-2000100區(qū)域（5）點(diǎn)擊“g

2、et sequence”，出現(xiàn)頁(yè)面中最上面的序列“>uc001kfb.1 (promoter 2000 100) PTEN - phosphatase and tensin homolog”就是你要的人PTEN啟動(dòng)子-2000100區(qū)域的序列了 2、Ensembl（1）網(wǎng)址：/index.html在“Search Ensembl“標(biāo)題下search后的下拉框中選中物種名homo sapiens（人），for框中輸入基因名PTEN，點(diǎn)擊Go（2）出現(xiàn)的新頁(yè)面中比較亂，但不要管它，直接尋找“Ensembl protein coding ge

3、ne ”字樣的，對(duì)，也就是第二個(gè)，點(diǎn)擊它（3）新出現(xiàn)的頁(yè)面也很亂，不過(guò)依然不用管它，看到左側(cè)有點(diǎn)肉色（實(shí)在不知道怎么描述了）的那些選項(xiàng)了嗎，對(duì)，就是“Your Ensembl”下面那一堆，在里面找“Genomic sequence”，點(diǎn)它（4）現(xiàn)在的界面就一目了然了，在“5' Flanking sequence”中輸入數(shù)值確定啟動(dòng)子長(zhǎng)度（默認(rèn)為600），比如1000，點(diǎn)擊update；（5）出現(xiàn)的序列中，標(biāo)為紅色的就是基因的外顯子，紅色之間黑色的序列就是內(nèi)含子，而第一個(gè)紅色自然就是第一外顯子了，那么從開(kāi)始的堿基一直到第一個(gè)紅色的堿基間自然就是啟動(dòng)子-1000+1的序列啦這樣，你不僅查到

4、了啟動(dòng)子，連它的外顯子、內(nèi)含子序列也全部搞定了 3、SIB-EPD（1）網(wǎng)址：http:/www.epd.isb-sib.ch/（2）具體使用方法大同小異，就是輸入物種名、基因名，限定啟動(dòng)子序列區(qū)域不過(guò)有了前兩個(gè)，我想已經(jīng)足夠用了，個(gè)人感覺(jué)SIB-EPD的庫(kù)容量太小，很多基因查不到 總結(jié)一下：ensembl一般也和NCBI的一致，你的情況可能例外。這就不清楚了。ensembl有七個(gè)外顯子可能有它自己的理由。另外，NCBI的基因中g(shù)ene庫(kù)中同時(shí)有ensembl和genbank的鏈接，不如從這個(gè)鏈接看看。此外，還可以看一看這個(gè)基因在物種間的同源性，以及其它物種有幾個(gè)外顯子，做

5、為參考。綜合考慮一下。  給你提供幾個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域查找的網(wǎng)站，慢慢摸索會(huì)學(xué)到更多的。   通常確定啟動(dòng)子的算法可以分成兩種,一種根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)各種轉(zhuǎn)錄信號(hào),如TATA 盒、CCAAT 盒,結(jié)合對(duì)這些保守信號(hào)及信號(hào)間保守的空間排列順序的識(shí)別進(jìn)行預(yù)測(cè)。如PROMOTER 2.0, 用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法確定TATA 盒、CCAAT盒、加帽位點(diǎn)(cap site) 和GC 盒(GCbox) 的位置和距離, 識(shí)別含TATA 盒的啟動(dòng)子。 PROMOTER SCAN  根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位在基因組中分布的不平衡性,將轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位分布

6、密度與TATA 盒的權(quán)重矩陣(weight matrix) 結(jié)合起來(lái),從基因組DNA中識(shí)別出啟動(dòng)子區(qū)3 。但上述程序預(yù)測(cè)的假陽(yáng)性率較高,PROMOTER 210 每23kb 出現(xiàn)一個(gè)假陽(yáng)性;PRO2MOTER SCAN 平均每19kb 出現(xiàn)一個(gè)假陽(yáng)性。 PromoterInspector  另一種方法根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)序列的特征進(jìn)行預(yù)測(cè)。Promo2terInspector 從一組訓(xùn)練序列中提取出啟動(dòng)子區(qū)的環(huán)境特征,并將外顯子、內(nèi)含子和3端非翻譯區(qū)的特征與啟動(dòng)子區(qū)加以區(qū)分,從而在基因組中確定啟動(dòng)子位置初來(lái)乍到，發(fā)個(gè)技術(shù)貼了！1、獲取目的基因的mRNA序列，并且在NCBI

7、的數(shù)據(jù)庫(kù)中查獲轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)2、截取轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為中心，上下約各1000bp，若在此范圍內(nèi)出現(xiàn)CDS，可到翻譯起始點(diǎn)終止3、利用在線軟件進(jìn)行分析PromoterInspector  PromoterScan    NNPP  EMBOSS Cpgplot  CpG Islands Prediction 本人是采取多種軟件結(jié)合的方法，由于proscan和promoter 2.0的假陽(yáng)性率較高，僅作為參考，而promoterinspector的特異性較高，結(jié)果比較可信。同時(shí)，利用CpG島預(yù)測(cè)，作

8、為輔助參考4、最后，可以找到小鼠的同源區(qū)，進(jìn)行同源性比較，啟動(dòng)子區(qū)域一定是高保守區(qū)5、到此，可以初步預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域的范圍了。請(qǐng)高手多多指教！啟動(dòng)子預(yù)測(cè)：/molbio/proscan/轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)：http:/www.gene-此處亦有好多，自己挑吧！以下內(nèi)容轉(zhuǎn)自啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)及預(yù)測(cè)工具PROMOTER FINDING AND ANALYSIS PROGRAMS ON THE INTERNET - TRANSPLORER (TRANScription exPLORER) Dnanalyze (T

9、F mapping) Dragon Promoter Finder 1.2 (TSS finder and promoter region analysis)  HCtata (TATA signal prediction)  MatInspector (Search for TF binding sites) ModelGenerator and ModelInspector NNPP2.1 (TSS finder) PromoterInspector (Strand non-specific promoter

10、region finder) Promoter2.0 (TSS finder) Promoter Scan II (Promoter region prediction) RGSiteScan Signal Scan (Search for Eukaryotic Transcriptional Elements) TESS (Search for Transcription Elements) TFSEARCH (Predicts TF binding sites based on TRANSFAC data) TRANSF

11、AC (TF database and a number of associated programs) TSSG and TSSW   通常確定啟動(dòng)子的算法可以分成兩種,一種根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)各種轉(zhuǎn)錄信號(hào),如TATA 盒、CCAAT 盒,結(jié)合對(duì)這些保守信號(hào)及信號(hào)間保守的空間排列順序的識(shí)別進(jìn)行預(yù)測(cè)。如PROMOTER 2.0, 用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法確定TATA 盒、CCAAT盒、加帽位點(diǎn)(cap site) 和GC 盒(GCbox) 的位置和距離, 識(shí)別含TATA 盒的啟動(dòng)子。 PROMOTER SCAN  根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位在基因組

12、中分布的不平衡性,將轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位分布密度與TATA 盒的權(quán)重矩陣(weight matrix) 結(jié)合起來(lái),從基因組DNA中識(shí)別出啟動(dòng)子區(qū)3 。但上述程序預(yù)測(cè)的假陽(yáng)性率較高,PROMOTER 210 每23kb 出現(xiàn)一個(gè)假陽(yáng)性;PRO2MOTER SCAN 平均每19kb 出現(xiàn)一個(gè)假陽(yáng)性。 PromoterInspector  另一種方法根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)序列的特征進(jìn)行預(yù)測(cè)。Promo2terInspector 從一組訓(xùn)練序列中提取出啟動(dòng)子區(qū)的環(huán)境特征,并將外顯子、內(nèi)含子和3端非翻譯區(qū)的特征與啟動(dòng)子區(qū)加以區(qū)分,從而在基因組中確定啟動(dòng)子位置 FirstEF&#

13、160; 近來(lái)還有一些程序?qū)⑸鲜龇椒ㄅcCpG 島(CpG islands) 信息相結(jié)合。CpG島是一段200 bp 或更長(zhǎng)的DNA 序列,核苷酸G + C 的含量較高,并且CpG雙核苷酸的出現(xiàn)頻率占G+ C 含量的50 %以上。許多脊椎動(dòng)物的啟動(dòng)子區(qū)都與CpG島的位置重合。FirstEF ( http :/ / rulai1cshl1org/ tools/ FirstEF/ ) 搜索通過(guò)5UTR 定位技術(shù)構(gòu)建的第一外顯子數(shù)據(jù)庫(kù),識(shí)別第一剪切點(diǎn)(first splicing donor site) ,結(jié)合CpG 島信息,確定啟動(dòng)子區(qū)。這種方法使預(yù)測(cè)的敏感性和特異性都明顯提高。該程序預(yù)測(cè)

14、含CpG島的啟動(dòng)子的敏感性和特異性都高于90 % ,預(yù)測(cè)不含CpG島的啟動(dòng)子的精確性相對(duì)略低。 TRRD 數(shù)據(jù)庫(kù)  收錄了真核基因調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)方式的信息,每個(gè)條目對(duì)應(yīng)一個(gè)基因。 應(yīng)用權(quán)重矩陣數(shù)據(jù)庫(kù)搜索轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的程序包括 SIGNAL SCAN  MatInspector  轉(zhuǎn)錄因子搜索程序( transcriptional factor search , TF2 SEARCH )  等等。盡管基于PWM 的搜索比較敏感,但它最大的缺點(diǎn)就是假陽(yáng)性率過(guò)高,在預(yù)測(cè)的

15、結(jié)果中有很多結(jié)合部位并不真正具有生物學(xué)功能。 COMPEL 數(shù)據(jù)庫(kù)  經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的復(fù)合元件不多,COMPEL 數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄了近200 條經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的復(fù)合元件的信息。如果轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的預(yù)測(cè)結(jié)果中包含復(fù)合元件,顯然比單個(gè)元件更有可能具有生物學(xué)功能。Co - Bind 程序通過(guò)建立兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的PWM 及其復(fù)合作用的模型,可以預(yù)測(cè)序列中的復(fù)合元件。還有一些程序利用COMPEL 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的復(fù)合元件去搜索基因組序列。 Consensus  AlignACE  等是用來(lái)搜索高含量基序(overrepresent

16、ed motif finding) 的一些算法,可以對(duì)一組基因簇中的基因調(diào)控區(qū)進(jìn)行比較,以發(fā)現(xiàn)其中存在的高含量的基序,調(diào)控元件可能就存在于這些基序之中。在UCSC查找可能的啟動(dòng)子1、進(jìn)入網(wǎng)站  。2、點(diǎn)擊Tables菜單，在position后面的搜索框內(nèi)寫入待查的基因名稱，點(diǎn)擊getoutput。3、出現(xiàn)一系列候選序列。當(dāng)搜索用詞不特異的時(shí)候會(huì)出來(lái)太多的結(jié)果，只顯示500條。4、點(diǎn)擊自己目的基因的結(jié)果鏈接，會(huì)出現(xiàn)該基因在染色體上的位置 (有時(shí)候會(huì)直接跳到選擇genome，protein，mRNA那一頁(yè)面，可能是在搜索詞比較特異的情況寫)，繼續(xù)getoutput。5、選擇ge

17、nome這一項(xiàng)。6、promoter/upstream前面的框中打勾，一般的啟動(dòng)子長(zhǎng)度大約為2kb左右，這個(gè)數(shù)字可以修改。為便于觀察，可繼續(xù)修改下面的幾個(gè)選項(xiàng)。這里選擇CDS大寫。7、點(diǎn)擊get sequence即可得到結(jié)果。UTR和upstream是分開(kāi)的，CDS是大寫的，可以看到起始碼。copyATG以前的序列進(jìn)行啟動(dòng)子分析。PCR以genome為模板。在Ensembl查找可能的啟動(dòng)子1、進(jìn)入網(wǎng)站，選擇物種，填入搜索的基因名稱。2、出來(lái)2個(gè)結(jié)果。本例中貌似是同一個(gè)。點(diǎn)擊相應(yīng)鏈接進(jìn)入新頁(yè)面。 3、貌似有2個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本。點(diǎn)擊Exon Info。 4、新頁(yè)面中即可看到5&#

18、39; upstream sequence?？梢栽贔lanking sequence at either end of transcript后面的框中修改期望顯示的序列長(zhǎng)度。一般啟動(dòng)子最好選>2kb。然后copy所顯示的上游序列進(jìn)行分析。 隨著基因工程的發(fā)展，常常需要構(gòu)建一種能高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。啟動(dòng)子對(duì)外源基因的表達(dá)水平影響很大，是基因工程表達(dá)載體的重要元件。因此研究啟動(dòng)子的克隆方法，對(duì)研究基因表達(dá)調(diào)控和構(gòu)建表達(dá)載體至關(guān)重要。 迄今為止，國(guó)外尚未見(jiàn)到有關(guān)啟動(dòng)子克隆方法的綜述性報(bào)道，國(guó)內(nèi)僅孫曉紅等曾就啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、分類、克隆方法和食用菌中已經(jīng)分離到的啟動(dòng)子

19、作過(guò)綜述。而近年來(lái)又有許多改進(jìn)的克隆啟動(dòng)子的方法獲得了多方面的成功，本文就近年來(lái)改進(jìn)的啟動(dòng)子克隆方法作一綜述，以期促進(jìn)對(duì)啟動(dòng)子分離技術(shù)的應(yīng)用。 1啟動(dòng)子克隆的幾種方法 1.1利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子 啟動(dòng)子探針型載體是一種有效、經(jīng)濟(jì)、快速分離基因啟動(dòng)子的工具型載體，包含2個(gè)基本部分：轉(zhuǎn)化單元和檢測(cè)單元。其中，轉(zhuǎn)化單元含復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因，用于選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；檢測(cè)單元?jiǎng)t包括1個(gè)已失去轉(zhuǎn)錄功能且易于檢測(cè)的遺傳標(biāo)記基因以及克隆位點(diǎn)。 利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子的過(guò)程為，先選用1種適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶消化切割染色體DNA，然后將切割產(chǎn)生的DNA限

20、制片段群體與無(wú)啟動(dòng)子的探針質(zhì)粒載體重組，并按照設(shè)計(jì)的要求使克隆的片段恰好插在緊鄰報(bào)告基因的上游位置；隨后再把重組混合物轉(zhuǎn)化給寄主細(xì)胞，構(gòu)建質(zhì)粒載體基因文庫(kù)，并檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)活性。 當(dāng)插入段同時(shí)滿足(1)具有基因啟動(dòng)子序列；(2)具有翻譯啟始區(qū)；(3)具有啟始MM子；(4)插入方向正確；(5)插入片段3'端編碼區(qū)序列抗性基因編碼區(qū)讀碼框一致，則有可能形成有功能的抗性融合基因，從而啟動(dòng)抗性基因的表達(dá)。 最早由Rachael等在大腸桿菌中以四環(huán)素抗性基因作為報(bào)告基因構(gòu)建了啟動(dòng)子探針質(zhì)粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核啟動(dòng)子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作為

21、報(bào)告基因，F(xiàn)odor等以大腸桿菌LacZ為報(bào)告基因，構(gòu)建了酵母啟動(dòng)子探針質(zhì)粒并克隆了一些啟動(dòng)子片段。構(gòu)建啟動(dòng)子探針型載體，較為常見(jiàn)的檢測(cè)標(biāo)記基因有-半乳糖苷酶基因(lacZ)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、四環(huán)素抗性基因(Tet')和卡那霉素抗性基因(Kan')。近年來(lái)，人們漸漸較多地使用潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hph)基因作為檢測(cè)標(biāo)記基因。李維等曾構(gòu)建了含有hph抗性基因的啟動(dòng)子探針型載體pSUPV8，直接在大腸桿菌中分離黃孢原毛平革菌基因的啟動(dòng)子。先用Sau3AI酶切黃孢原毛平革菌基因總DNA，再與用BamHI酶切后的pSUPV8相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用間接篩選法從氨芐青霉素和

22、潮霉素抗性平板上篩選重組子，得到6個(gè)雙抗重組子(pCH1pCH6)，電泳檢測(cè)插入片段分別命名為CHlCH6；再用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將重組子分別轉(zhuǎn)化黃孢原毛平革菌，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行復(fù)篩，僅pCH6的轉(zhuǎn)化平板上有穩(wěn)定生長(zhǎng)的菌落，說(shuō)明了CH6片段在黃孢原毛平革菌中具有啟動(dòng)基因表達(dá)的功能。該方法不需要知道具體基因的序列，可隨機(jī)篩選啟動(dòng)子，避免了引物設(shè)計(jì)，能獲得大量的啟動(dòng)子片段。 1.2利用PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子 即根據(jù)發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)引物，克隆基因的啟動(dòng)子，由于PCR法簡(jiǎn)便快捷，近年來(lái)人們較多采用此方法克隆基因啟動(dòng)子。 蘇寧等根據(jù)已報(bào)道的水稻葉綠體16SrRNA啟動(dòng)子基因

23、序列設(shè)計(jì)5'啟動(dòng)子序列的引物，以水稻葉綠體DNA為模板，PCR擴(kuò)增出16SrRNA基因5'啟動(dòng)子區(qū)的片段，酶切克隆到pSK的SacI和SphI位點(diǎn)，構(gòu)建測(cè)序載體質(zhì)粒pZ16S，進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明所克隆的片段長(zhǎng)為144bp，含有SD序列。同源比較結(jié)果表明，所克隆的片段與水稻葉綠體16SrRNA啟動(dòng)子序列具有100的同源性。 上述的PCR方法簡(jiǎn)便、快捷、操作簡(jiǎn)單，是人們較為廣泛使用的技術(shù)。 1.3環(huán)狀PCR 環(huán)狀PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。這2種PCR都是根據(jù)一端已知序列設(shè)計(jì)的嵌套式引物

24、進(jìn)行PCR。 1.3.1I-PCR I-PCR是1988年由Triglia最早提出的一種基于PCR的改進(jìn)的染色體步行方法。I-PCR的實(shí)驗(yàn)程序包括，基因組DNA經(jīng)酶切后用T4DNA連接酶進(jìn)行自連接，產(chǎn)生環(huán)狀DNA片段；以環(huán)化產(chǎn)物為底物，用根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到含有未知片段的擴(kuò)增產(chǎn)物(流程如圖1所示)。 韓志勇等以I-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)克隆了轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因旁側(cè)序列。先用小量法提取轉(zhuǎn)基因水稻的總DNA，總DNA用10倍過(guò)量的限制內(nèi)切酶進(jìn)行過(guò)夜酶切，酶切片段進(jìn)行自連接，然后根據(jù)工程質(zhì)粒的T-DNA區(qū)設(shè)計(jì)2對(duì)反向引物，進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增旁側(cè)序列。建立

25、了適合于處理大量材料的克隆轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因旁側(cè)序列的技術(shù)體系。在1周內(nèi)克隆了35個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻株系中外源基因的旁側(cè)序列，長(zhǎng)度在300750bp之間。I-PCR法快速、高效、穩(wěn)定，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，花費(fèi)少，PCR引物設(shè)計(jì)比較方便。 1.3.2P-PCR P-PCR是由Jones等提出的利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀單鏈模板，有效增強(qiáng)了引物與模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)需要3個(gè)根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的引物，3個(gè)引物在已知序列內(nèi)呈線性排列，其中第3個(gè)引物可作為接頭使用，可與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成鍋柄狀單鏈模板。其過(guò)程為，首先酶切基因組DNA，產(chǎn)生5'或3'粘末端，然后連接上

26、合適的接頭(primer 3)，連接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接頭，由于連接上的接頭與已知序列是反向重復(fù)序列，變性后的DNA單鏈可退火形成鍋柄狀單鏈模板，之后分別用3個(gè)單引物進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增，能有效地?cái)U(kuò)增29kbp的大片段未知序列(流程如圖2所示)。 黃君健等成功地應(yīng)用P-PCR技術(shù)從正常的人外周血單核細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增端粒催化亞基hTERT基因5'端上游旁側(cè)序列，獲得了hTERT基因翻譯啟始位點(diǎn)上游2090bp的基因組DNA序列。首先用酶切消化基因組DNA，得到帶有GATC的5'突出端的DNA片段。然后利用已知的hTERTcDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，用常

27、規(guī)的PCR方法擴(kuò)增出1條大約900bp的基因組特異片段，序列分析為hTERT的基因組DNA片段。根據(jù)得到的基因組DNA序列的信息，確定P-PCR的引物退火區(qū)，并合成了5'磷酸化的連接寡核苷酸和4條基因特異性引物，其中連接寡核苷酸5'端的4個(gè)堿基CTAG與上述核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的5'突出端GATC互補(bǔ)，然后將連接寡核苷酸與基因組酶切產(chǎn)物連接，以連接產(chǎn)物為反應(yīng)模板，進(jìn)行PCR，使模板自身進(jìn)行退 火-延伸反應(yīng)，以形成Panhandle結(jié)構(gòu)。最后以單鏈Panhandle為模板，4條基因特異序列為引物進(jìn)行嵌套式PCR，最終獲得了1條約2kb的含hTERT基因啟動(dòng)子的DNA片段。J

28、ones等利用改進(jìn)的P-PCR，在形成panhandle結(jié)構(gòu)之前3'末端連上ddCTP，使引物錯(cuò)配的機(jī)率減少，特異性增加。他們從人類基因組DNA已知位點(diǎn)側(cè)翼擴(kuò)增了49kb的大片段未知序列。P-PCR是目前能夠擴(kuò)增距已知序列最遠(yuǎn)的未知DNA序列的方法，有很高的特異性。 1.4利用載體或接頭的染色體步行技術(shù)克隆基因啟動(dòng)子 這類方法的第一步都是酶切基因組DNA，連接載體或接頭，既可以用pUCl8等質(zhì)粒載體，也可以使用DNA等噬菌體載體，只要選用的載體帶有合適的酶切位點(diǎn)；同樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，接頭既可以是雙鏈也可以是單鏈，然后根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計(jì)的特異引物和載體的通用引物或

29、接頭序列進(jìn)行擴(kuò)增。 1.4.1利用載體的PCR Shyamala等利用的單特異性引物PCR(SSP-PCR)對(duì)以小鼠傷寒桿菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子為起點(diǎn)進(jìn)行連續(xù)步行。以M13mpl8RF DNA為載體。用PstI和AraI酶切基因組DNA，PstI和XmaI酶切載體DNA，然后連接基因組片段和載體片段，用根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計(jì)的特異引物和載體的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，由于非特異片段沒(méi)有單特異引物結(jié)合的位點(diǎn)，即使有載體連到非特異片段，也無(wú)法得到大量擴(kuò)增，而使特異片段得到有效擴(kuò)增。 1.4.2利用接頭的PCR王新國(guó)等利用銜接頭的方法，設(shè)計(jì)了位于單鏈DNA兩端互補(bǔ)的顛倒末端重復(fù)序列，增加了

30、反應(yīng)的特異性，在胡蘿卜II型轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子的克隆方面取得了新的進(jìn)展。首先將胡蘿卜基因組DNA分別用PvuI、SmaI、DraI、EcoRV酶切，并設(shè)計(jì)了1個(gè)銜接頭長(zhǎng)鏈序列和1個(gè)銜接頭短鏈序列，并在銜接頭短鏈的3'末端帶有1個(gè)氨基的銜接頭，能夠阻止聚合酶催化的銜接頭短鏈的延伸，同時(shí)銜接頭的長(zhǎng)鏈和短鏈之間是反向重復(fù)序列。將酶切片段與此銜接頭連接，取連接產(chǎn)物做模板，以銜接頭引物和基因特異引物做PCR，在首輪PCR中只有限定的遠(yuǎn)端基因特異引物有結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)基因特異引物延伸產(chǎn)生的DNA鏈通過(guò)銜接頭時(shí)，才能產(chǎn)生銜接頭引物的結(jié)合位點(diǎn)，PCR才能以銜接頭引物和基因特異引物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。而另一方面，如

31、果非特異合成產(chǎn)生了DNA兩端都有雙鏈銜接頭序列的PCR產(chǎn)物時(shí)，這種PCR產(chǎn)物在每次變性后，單鏈DNA末端的銜接頭反向重復(fù)序列將形成鍋柄結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)比引物-模板雜交更穩(wěn)定，能抑制非特異序列的指數(shù)增長(zhǎng)。最后得到主要的PCR產(chǎn)物為3.4kb、1.3kb、0.6kb和0.4kb。將EcoR V-銜接頭體系的PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序、同源性比較，得到1個(gè)新的胡蘿卜II型轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子序列，它含有類似于TATA box和CAAT box的元件，在啟動(dòng)子的遠(yuǎn)上游區(qū)域含多個(gè)AT富含區(qū)，該啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究植物中的糖代謝具有重要的意義。接頭引物的相對(duì)位置如圖3所示。 這種方法具有便于操作、實(shí)驗(yàn)線路簡(jiǎn)單

32、的優(yōu)點(diǎn)，但是特異性較差，產(chǎn)物需進(jìn)一步雜交驗(yàn)證。 1.5YADE法 Prashar等在擴(kuò)增cDNA3'端時(shí)采用“Y”形接頭，以減少接頭引物的單引物擴(kuò)增。其原理是接頭引物處于“Y”接頭的2個(gè)分叉單鏈上，序列與接頭一樣，只有與特異引物引導(dǎo)合成了接頭的互補(bǔ)序列后，接頭引物才能退火參與擴(kuò)增，流程如圖4。 方衛(wèi)國(guó)等嘗試將YADE法引入到昆蟲(chóng)病原真菌的分子生物學(xué)研究，并取得了成功，建立了適合于球孢白僵菌和金龜子綠僵菌YADE體系。在已克隆的類球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的基礎(chǔ)上，利用YADE法，克隆到該基因的啟動(dòng)子CDEPP。 先酶切球孢白僵菌基

33、因組DNA，然后與“Y”形接頭相連，取連接產(chǎn)物做模板，先以基因特異引物1做線性擴(kuò)增，再以線性擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以接頭引物和基因特異引物2做指數(shù)擴(kuò)增，只有當(dāng)線性擴(kuò)增時(shí)合成了含有接頭引物的互補(bǔ)單鏈，接頭引物才能與其發(fā)生退火，參與指數(shù)擴(kuò)增，從而有效防止了接頭引物的單引物擴(kuò)增。最后得PCR產(chǎn)物，進(jìn)行序列分析確定為CDEP-1的上游啟動(dòng)子序列。 在應(yīng)用YADE法時(shí)，內(nèi)切酶的選擇至關(guān)重要。好的內(nèi)切酶產(chǎn)生適合PCR擴(kuò)增的片段，太大太小都不行。為了得到合適的內(nèi)切酶，需要從眾多的內(nèi)切酶中篩選。研究表明，不同的物種有自己合適的內(nèi)切酶。YADE法延伸的起始片段可以是基因組 DNA片段，也可以是cDNA片段，

34、在延伸cDNA片段時(shí)，設(shè)計(jì)的引物需要避開(kāi)內(nèi)含子和外顯子的邊界，在內(nèi)含子的位置未知的情況下，可考慮多合成12條特異引物，以提高擴(kuò)增未知片段的機(jī)率。該方法假陽(yáng)性低、效率高，理論上能擴(kuò)出所有目的片段。 1.6TAlL-PCR 很早就有用隨機(jī)引物的PCR，但由于無(wú)法有效地控制由隨機(jī)引物引發(fā)的非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，所以一直未能廣泛應(yīng)用。近年來(lái)由IJiu等設(shè)計(jì)的TAIL-PCR(Termal Asymmetric Interlaced PCR)又叫熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR，則解決了這個(gè)問(wèn)題，后來(lái)有研究表明，經(jīng)改良過(guò)的TAIL-PCR成功地從突變體中克隆到外源插入基因的旁側(cè)序列，從而為啟動(dòng)子的克隆

35、提供了有效的新方法。 在利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行PCR中一般有3種產(chǎn)物生成：(1)由特異性引物和簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物；(2)由同一特異性弓l物擴(kuò)增出的產(chǎn)物；(3)由同一簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物。在TAIL-PCR反應(yīng)中，其中后2種目標(biāo)產(chǎn)物可以通過(guò)以嵌套的特異性引物進(jìn)行的后續(xù)反應(yīng)來(lái)消除。 TAIL-PCR的基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物(specialprimer，簡(jiǎn)稱sp1，sp2，sp3，約20bp)，用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物(Arbitrarydegenerate prime，AD，約14bp)相組合，以基因組DNA為模板

36、根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán)，通過(guò)分級(jí)反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增特異引物(流程如圖5所示)。 TAIL-PCR共分3次反應(yīng)。第一次反應(yīng)包括5次高特異性、1次低特異、10次較低特異性反應(yīng)和12個(gè)熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)。5次高特異性反應(yīng)，使sp1與已知的序列退火并延伸，增加了目標(biāo)序列的濃度；1次低特異性的反應(yīng)使簡(jiǎn)并引物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上；10次較低特異性反應(yīng)使2種引物均與模板退火，隨后進(jìn)行12次超級(jí)循環(huán)。經(jīng)上述反應(yīng)得到了不同濃度的3種類型產(chǎn)物：特異性產(chǎn)物型和非特異性產(chǎn)物(型和型)。第二次反應(yīng)則將第一級(jí)反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋1000倍作為模板，通過(guò)10次熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)，使特異性產(chǎn)物被選擇地

37、擴(kuò)增，而非特異產(chǎn)物含量極低。第三次反應(yīng)又將第二次反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋作模板，再設(shè)置普通的PCR反應(yīng)或熱不對(duì)稱超級(jí)循環(huán)，通過(guò)上述3次PCR反應(yīng)可獲得與已知序列鄰近的目標(biāo)序列。 Gento等曾用構(gòu)建的含有潮霉素抗性基因(hph)的雙元表達(dá)載體pBIG2RHPH2轉(zhuǎn)化真菌，然后利用TAIL-PCR法克隆得到的真菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA的T-DNA插入?yún)^(qū)的旁側(cè)序列并取得了成功。根據(jù)T-DNA區(qū)的HPH基因設(shè)計(jì)了擴(kuò)增右邊界的3個(gè)引物HS1HS3，以及擴(kuò)增左邊界的引物HAS2HAS4，另外又根據(jù)不同的轉(zhuǎn)化子分別設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物ADlAD3(引物位置如圖6所示)。 在首輪PCR中，以AD/HS1為引

38、物擴(kuò)增右邊界(以AD/HAS2擴(kuò)增左邊界)，然后取首輪PCR產(chǎn)物為模板，以AD/HS2(AD/HAS3)進(jìn)行二次PCR，再以二次PCR產(chǎn)物為模板，AD/HS3(AD/HAS4)為模板進(jìn)行第三輪PCR，將3輪的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析結(jié)果表明，采用TAIL-PCR的方法成功地從突變體中獲得了帶有T-DNA左右邊界的旁側(cè)序列，從而證明了TAIL-PCR法是有效地?cái)U(kuò)增基因旁側(cè)序列的方法，為啟動(dòng)子的克隆又增添了1種可行的方法。 TAIL-PCR不需要PCR前的任何DNA操作，避免了環(huán)化和連接，速度快，特異性強(qiáng)，效率高，靈敏，在分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。 2討論 

39、;以上介紹的幾種方法基本代表了現(xiàn)有的啟動(dòng)子克隆方法，它們分別具有不同的特點(diǎn)和適用范圍。 利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子時(shí)，不需要知道具體的基因序列，避免了引物設(shè)計(jì)，并能獲得大量的啟動(dòng)子片段；其缺點(diǎn)是需要構(gòu)建1個(gè)穿梭質(zhì)粒，建庫(kù)、轉(zhuǎn)化、篩選，工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且克隆、亞克隆的過(guò)程繁瑣。因此在基因的遺傳背景不是很清楚時(shí)，往往通過(guò)探針載體隨機(jī)篩選啟動(dòng)子。 而PCR法的主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快捷、操作簡(jiǎn)單；其缺點(diǎn)是只能擴(kuò)增兩端已知序列間的DNA區(qū)，且擴(kuò)增的特異性較低。其適用條件是建立在對(duì)基因序列十分清楚的基礎(chǔ)上，只有知道基因的全序列，才可根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出該基因的啟動(dòng)子。因此，

40、在基因序列清楚的情況下我們首先想到的就是PCR法。 I-PCR法操作簡(jiǎn)單，克服了文庫(kù)篩選、克隆、亞克隆的繁瑣步驟，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高，花費(fèi)少，在PCR法的基礎(chǔ)上，增加了DNA的環(huán)化過(guò)程，從而可以擴(kuò)增只有一端序列已知的DNA，由于不需要設(shè)計(jì)和合成大量昂貴的核苷酸接頭，因此避免了引物設(shè)計(jì)和有接頭而產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物的麻煩；然而由于直接克隆已知序列外的未知DNA區(qū)域依賴于DNA的環(huán)化性，而環(huán)化連接過(guò)程中常常產(chǎn)生多聯(lián)體，成為副產(chǎn)物甚至是主要產(chǎn)物，導(dǎo)致非特異擴(kuò)增，造成了閉環(huán)雙鏈的DNA的PCR擴(kuò)增效率差，經(jīng)常得不到滿意的結(jié)果，同時(shí)酶切片段太長(zhǎng)也會(huì)使擴(kuò)增效率下降。其適用于尋找只有一端序列已知的D

41、NA,對(duì)未知DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。 相對(duì)于I-PCR，P-PCR經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)形成的是鍋柄狀單鏈DNA模板，從而有效增加了引物與模板結(jié)合的特異性，p-PCR能夠完成全部嵌套式擴(kuò)增，因而產(chǎn)物有非常高的特異性；其缺點(diǎn)是也存在DNA環(huán)化、連接的弊端，但與I-PCR相比，其PCR產(chǎn)物的特異性已大大增加。目前，P-PCR可以擴(kuò)增位于已知位點(diǎn)側(cè)翼的大于3.0kb的人基因組DNA的啟動(dòng)子，是目前為止能擴(kuò)增距離已知序列最遠(yuǎn)的DNA序列的方法因而常用于擴(kuò)增大片段的未知序列。 利用載體的PCR克隆啟動(dòng)子有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，在基因組DNA中加入含合適酶切位點(diǎn)的載體，是基于PCR法的又一創(chuàng)新之處；然而其實(shí)驗(yàn)操作較為繁瑣，特異性差，即使用套式PCR