生化實驗技術(shù)專題

1、生化實驗技術(shù)專題生化實驗技術(shù)專題 主要內(nèi)容和要求：以蛋白質(zhì)分離純化為例主要內(nèi)容和要求：以蛋白質(zhì)分離純化為例介紹生物大分子分離純化的一般步驟和注意事介紹生物大分子分離純化的一般步驟和注意事項；介紹層析技術(shù)、電泳技術(shù)、離心技術(shù)的原項；介紹層析技術(shù)、電泳技術(shù)、離心技術(shù)的原理及其應(yīng)用；總結(jié)蛋白質(zhì)、核酸、酶、氨基酸理及其應(yīng)用；總結(jié)蛋白質(zhì)、核酸、酶、氨基酸測定的主要方法測定的主要方法。第一節(jié)第一節(jié) 生物大分子物質(zhì)的制備生物大分子物質(zhì)的制備第二節(jié)第二節(jié) 幾種主要的生物化學(xué)實驗技術(shù)幾種主要的生物化學(xué)實驗技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 生物分子的檢測生物分子的檢測第一節(jié)第一節(jié) 生物大分子物質(zhì)的制備生物大分子物質(zhì)的制備一一一般

2、過程一般過程二二注意事項注意事項三純化方案的設(shè)計和評價三純化方案的設(shè)計和評價例：例：宇佐美曲霉宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化酸性蛋白酶的純化材料的選擇和處理材料的選擇和處理確立測定方法確立測定方法細(xì)胞的破碎細(xì)胞的破碎有效成分的抽提有效成分的抽提有效成分的濃縮有效成分的濃縮生物大分子分離純化的一般步驟生物大分子分離純化的一般步驟層析法層析法 電泳法電泳法 超離心法超離心法 超濾超濾鹽析鹽析（硫酸銨鹽析硫酸銨鹽析）等點電沉淀等點電沉淀有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀透析透析前處理前處理 粗分級粗分級 細(xì)分級細(xì)分級 材料選擇與處理材料選擇與處理細(xì)胞破碎（機(jī)械破細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、溶賬和自溶、碎、溶賬和自溶

3、、酶解、化學(xué)處理）酶解、化學(xué)處理）生物組織生物組織無細(xì)胞提取液無細(xì)胞提取液粗產(chǎn)品粗產(chǎn)品結(jié)晶結(jié)晶注意事項注意事項1控制適當(dāng)?shù)目刂七m當(dāng)?shù)膒H2控制低溫控制低溫3注意提取過程中的溶液環(huán)境注意提取過程中的溶液環(huán)境4防止提純過程中丟失一些輔助因子或亞基防止提純過程中丟失一些輔助因子或亞基宇佐美曲霉宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化酸性蛋白酶的純化 純化步驟純化步驟 總蛋白總蛋白 總活力總活力 比活力比活力 純化倍數(shù)純化倍數(shù) 回收率回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白）蛋白） （%）1、粗酶液、粗酶液 80 4320 54 1 1002、乙醇沉淀、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 833、醋酸

4、鈣沉淀、醋酸鈣沉淀 21 2980 141 2.64 694、鹽析、鹽析 4 1771 464 8.52 415、丙酮沉淀、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 276、結(jié)晶、結(jié)晶 0.12 130 1072 19.70 3一、一、層析技術(shù)層析技術(shù)二二 、電泳技術(shù)電泳技術(shù)三三 、離心技術(shù)離心技術(shù)1層析技術(shù)一般原理層析技術(shù)一般原理2層析技術(shù)分類及應(yīng)用層析技術(shù)分類及應(yīng)用 層析技術(shù)是一種物理的分離方法。無論何種層析，其系統(tǒng)層析技術(shù)是一種物理的分離方法。無論何種層析，其系統(tǒng)通常由互不相溶的兩個相組成：一是固定相（固體或吸附在固通常由互不相溶的兩個相組成：一是固定相（固體或吸附在固體上的液體），

5、一是流動相（液體或氣體）。層析時，利用混體上的液體），一是流動相（液體或氣體）。層析時，利用混合物中各組分理化性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極合物中各組分理化性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速布在兩相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速度移動而最終被分離。度移動而最終被分離。樣品在層析時的移動速度可用遷移率樣品在層析時的移動速度可用遷移率RfRf值表示：值表示： 樣品原點到斑點中心的距離樣品原點到斑點中心的距離 R

6、fRf= = 樣品原點到溶劑前沿的距離樣品原點到溶劑前沿的距離 紙層析紙層析 薄膜層析薄膜層析 柱層析柱層析洗脫液洗脫液樣品樣品填充物填充物分部收集分部收集玻璃柱玻璃柱緩沖液泵緩沖液泵顯色反顯色反應(yīng)管應(yīng)管茚三酮泵茚三酮泵已分開的已分開的氨基酸氨基酸離子交換柱離子交換柱樣品注入口樣品注入口記錄儀記錄儀光電倍光電倍增管增管光源光源 吸附層析吸附層析分配層析分配層析凝膠過濾凝膠過濾（分子篩層析（分子篩層析）離子交換層析離子交換層析親和層析親和層析 聚焦層析聚焦層析各類層析的原理和載體各類層析的原理和載體類別類別 分離原理分離原理 基質(zhì)或載體基質(zhì)或載體吸附層析吸附層析 化學(xué)、物理吸附化學(xué)、物理吸附 硅

7、膠、氧化鋁硅膠、氧化鋁 、羥基磷酸、羥基磷酸分配層析分配層析 兩溶劑相中的溶解效應(yīng)兩溶劑相中的溶解效應(yīng) 纖維素、硅藻土纖維素、硅藻土 、硅膠、硅膠凝膠層析凝膠層析 分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng)分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng) sepharose 、sephadex離子交換層析離子交換層析 離子基團(tuán)的交換反應(yīng)離子基團(tuán)的交換反應(yīng) 離子交換樹脂離子交換樹脂 、纖維素、纖維素、 葡聚糖葡聚糖親和層析親和層析 分離物與配體之間有分離物與配體之間有 帶配基的帶配基的sepharose 特殊親和力特殊親和力 或或sephadex聚焦層析聚焦層析 等電點和離子交換作用等電點和離子交換作用 多緩沖交換劑（與帶有多種電多緩沖交換劑（

8、與帶有多種電 荷基團(tuán)的配體相偶聯(lián)的荷基團(tuán)的配體相偶聯(lián)的 sepharose 6B）原理：原理： 以吸附劑作為固定相，選擇適以吸附劑作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┳髁鲃酉?。由于各種物質(zhì)當(dāng)?shù)娜軇┳髁鲃酉唷Ｓ捎诟鞣N物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動相中的溶解度不同。層析和在流動相中的溶解度不同。層析時，當(dāng)流動相從固定相上流過時，時，當(dāng)流動相從固定相上流過時，各組分也就不同程度地被溶解（解各組分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動相向吸附，從而以不同速度隨流動相向前移動。前移動。 載體載體 ：

9、硅膠硅膠 氧化鋁氧化鋁 羥基磷石灰羥基磷石灰應(yīng)用：分離純化蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核苷應(yīng)用：分離純化蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核苷酸酸 等生化物質(zhì)等生化物質(zhì)原理：原理： 分配層析實際上是一種連續(xù)抽提方式。分配層析實際上是一種連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙的結(jié)合水為固定相，以水如紙層析中濾紙的結(jié)合水為固定相，以水飽和的有機(jī)溶劑為流動相（展開劑）。當(dāng)飽和的有機(jī)溶劑為流動相（展開劑）。當(dāng)流動相沿濾紙經(jīng)過樣品點時，樣品點中的流動相沿濾紙經(jīng)過樣品點時，樣品點中的溶質(zhì)在水和有機(jī)相中溶解度不同而不均勻溶質(zhì)在水和有機(jī)相中溶解度不同而不均勻地分配在兩相中，各種組分按其各自的分地分配在兩相中，各種組分按其各自的分配系數(shù)進(jìn)行不

10、斷分配，從而使物質(zhì)得到分配系數(shù)進(jìn)行不斷分配，從而使物質(zhì)得到分離和純化。離和純化。載體載體 ： 纖維素纖維素 硅藻土硅藻土 硅膠硅膠應(yīng)用：各種生化物質(zhì)的分離鑒定應(yīng)用：各種生化物質(zhì)的分離鑒定原理原理基質(zhì)基質(zhì) 葡聚糖凝膠（葡聚糖凝膠（sephadex） 瓊脂糖凝膠（瓊脂糖凝膠（sepharose）應(yīng)用應(yīng)用 測定分子量測定分子量 脫鹽和濃縮脫鹽和濃縮 分離提純生物大分子分離提純生物大分子 除去熱原物質(zhì)除去熱原物質(zhì)原理原理基質(zhì)基質(zhì) 疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應(yīng)用應(yīng)用 制備純化生物物質(zhì)制備純化生物物質(zhì) 定量、定性測定混合物中各組分定量、定性測定混合物中各組分1.平

11、衡階段平衡階段:離子交換劑離子交換劑與反離子結(jié)合與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換子進(jìn)行交換3、4. 解吸附階段：用解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用可重復(fù)使用12345原始緩沖溶原始緩沖溶液的反離子液的反離子樣品溶液樣品溶液梯度濃度梯度濃度應(yīng)用應(yīng)用 分離純化酶、分離純化酶、 抗原、抗體抗原、抗體 分離純化核酸分離純化核酸 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能研究酶的結(jié)構(gòu)與功能+待純化分子待純化分子配體配體a

12、. 待純化分子和配體間具有親和性待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)基質(zhì)b. 活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑+雜質(zhì)雜質(zhì)c. 待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d. 偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子原理：原理：基質(zhì)基質(zhì) 纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、 sepharose、sephadex 該法是在等電點聚焦方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質(zhì)的依該法是在等電點聚焦方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點在據(jù)是

13、等電點的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點在pH梯度環(huán)境中進(jìn)梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。 pH梯度的形成梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上梯度的層析柱上時，由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質(zhì)將迅速地時，由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質(zhì)將迅速地 遷移到與它等電點相同的遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電

14、點電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中，一種樣品分次加入時，只要先加入時被洗出。在聚焦層析過程中，一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的時間進(jìn)行聚焦，剩余樣品還可以加到柱上，其聚者尚未洗出，并且有一定的時間進(jìn)行聚焦，剩余樣品還可以加到柱上，其聚焦過程都能順利完成。焦過程都能順利完成。層析時的聚焦效應(yīng)示意圖層析時的聚焦效應(yīng)示意圖pH梯度溶液的形成示意圖梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)2（pI=8）流速流速移動速率移動速率 1電泳的一般原理電泳的一般原理 2. 電泳技術(shù)的類別電泳技術(shù)的類別 、原理及應(yīng)用、原理及應(yīng)用電泳的一般原理電泳的一般原理 電泳是帶電顆粒

15、在電場作用下向著與其電荷相反的電極電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象移動的現(xiàn)象 。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質(zhì)及其所在介質(zhì)的決于分子組成、性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pHpH。如果混合物中各組。如果混合物中各組分的結(jié)構(gòu)組成不同，在某一分的結(jié)構(gòu)組成不同，在某一pHpH溶液中，各組分所帶電荷性質(zhì)溶液中，各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場的作用下、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異，而達(dá)到分離鑒定各組分，各組分泳動的方向和速度也各異，而達(dá)到分離鑒

16、定各組分的目的。的目的。 紙電泳紙電泳 薄膜電泳薄膜電泳 凝膠電泳凝膠電泳 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳垂直板凝膠電泳垂直板凝膠電泳毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳1、醋酸纖維薄膜電泳、醋酸纖維薄膜電泳2、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）3、SDS-PAGE4、PAGE等電點聚焦等電點聚焦 3、瓊脂糖電泳、瓊脂糖電泳 4、毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳 凝膠聚合反應(yīng)及催化系統(tǒng)凝膠聚合反應(yīng)及催化系統(tǒng) 不連續(xù)不連續(xù)PAGE 可產(chǎn)生的三種效應(yīng)：可產(chǎn)生的三種效應(yīng)： 電荷效應(yīng)、電荷效應(yīng)、 分子篩分子篩 效應(yīng)、效應(yīng)、 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)原理：原理：

17、當(dāng)當(dāng)SDSSDS（Sodium DodecylSodium Dodecyl Sulfate Sulfate）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質(zhì)在質(zhì)分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質(zhì)在SDSSDS的作用的作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS -SDS -蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時產(chǎn)生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品

18、分時產(chǎn)生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系?？捎孟率奖硎荆鹤恿康膶?shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系?？捎孟率奖硎荆?Log M=a b應(yīng)用應(yīng)用: 測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)分子量 測定蛋白質(zhì)亞基數(shù)測定蛋白質(zhì)亞基數(shù)原理原理: 在一定抗對流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體在一定抗對流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和和pI值各值各自相異卻又相近自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極），當(dāng)直

19、流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其等電逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其等電點相等的點相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應(yīng)用：應(yīng)用： 高效率分離純化蛋白質(zhì)高效率分離純化蛋白質(zhì) 測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)分子量 微量多槽免疫電泳微量多槽免疫電泳 火箭免疫電泳火箭免疫電泳毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（ 2-2-75m75m）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管

20、兩端）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問題，實現(xiàn)了快速和高效分離。的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問題，實現(xiàn)了快速和高效分離。 毛細(xì)管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)，被認(rèn)為是毛細(xì)管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)，被認(rèn)為是9090年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、 DNADNA序列測定序列測定及及PCRPCR產(chǎn)物的分析鑒定等。產(chǎn)物的分析鑒定等。高壓電源高壓電源光源光源光電倍光電倍增管增管數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集毛細(xì)管毛細(xì)管緩沖液緩沖液-樣品樣品緩沖液緩沖液1離心機(jī)類別離心機(jī)類別 普通離心機(jī)普通離心機(jī) 6000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分 高速離心機(jī)高速離心機(jī) 2-3萬轉(zhuǎn)萬轉(zhuǎn)/分分 超速離心機(jī)超速離心機(jī) 3萬轉(zhuǎn)萬轉(zhuǎn)/分分2沉降系數(shù)（沉降系數(shù)（S