細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)原理

1、第一章 細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理與技術(shù) 現(xiàn)代生物技術(shù)一般認(rèn)為包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)有密切關(guān)系，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價(jià)值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產(chǎn)過(guò)程中很多是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的?；蚬こ桃腋我呙绾芏嗍且?CHO 細(xì)胞作為載體；細(xì)胞工程中更是離不細(xì)胞培養(yǎng)，雜交瘤單克隆抗體，完全是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，既使是現(xiàn)在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)。正在倍受重視的基因治療、體細(xì)胞治療也要經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程才能實(shí)現(xiàn)，發(fā)酵工程和酶工程有的也與細(xì)胞培養(yǎng)密切相關(guān)?？傊?，細(xì)胞培養(yǎng)在整個(gè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到

2、了很關(guān)鍵的核心作用。 第一節(jié) 體外培養(yǎng)的概念 一、基本概念 體外培養(yǎng)（in vitro culture） ，就是將活體結(jié)構(gòu)成分或活的個(gè)體從體或其寄生體取出，放在類(lèi)似于體生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長(zhǎng)和發(fā)育的方法。 組織培養(yǎng)：是指從生物體取出活的組織（多指組織塊）在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 細(xì)胞培養(yǎng)：是指將活細(xì)胞（尤其是分散的細(xì)胞）在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 器官培養(yǎng)：是指從生物體取出的器官（一般是胚胎器官） 、器官的一部分或器官原基在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 二、體、外細(xì)胞的差異和分化 1、差異：細(xì)胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的相對(duì)穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長(zhǎng)，易發(fā)生如下變

3、化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無(wú)限生長(zhǎng)的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體細(xì)胞一樣的基本結(jié)構(gòu)和功能， 也有一些不同于體細(xì)胞的性狀。 實(shí)際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開(kāi)始發(fā)生了。 2、分化：體外培養(yǎng)的細(xì)胞分化能力并未完全喪失，只是環(huán)境的改變，細(xì)胞分化的表現(xiàn)和在體不同。細(xì)胞是否表現(xiàn)分化,關(guān)鍵在于是否存在使細(xì)胞分化的條件，如 Friend 細(xì)胞（小鼠紅白血病細(xì)胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管皮細(xì)胞在類(lèi)似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時(shí)能長(zhǎng)成血管狀結(jié)構(gòu)，雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生特

4、異的單克隆抗體，這些均屬于細(xì)胞分化行為。 第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過(guò)程 一、準(zhǔn)備工作 準(zhǔn)備工作對(duì)開(kāi)展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或無(wú)法進(jìn)行。準(zhǔn)備工作的容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝與滅菌，無(wú)菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒，培養(yǎng)箱與其他儀器的檢查與調(diào)試。 二、取材 在無(wú)菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?，經(jīng)過(guò)一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過(guò)程稱(chēng)為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無(wú)取材這一過(guò)程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)稱(chēng)為原代培養(yǎng)。 理論上講各種動(dòng)物和人體的所有組織都可以用于

5、培養(yǎng)，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理，盡快培養(yǎng)， 因故不能馬上培養(yǎng)時(shí)，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4的培養(yǎng)液中保存。取組織時(shí)應(yīng)嚴(yán)格保持無(wú)菌，同時(shí)也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚與消化道上皮細(xì)胞時(shí)容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。 三、培養(yǎng) 將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過(guò)程稱(chēng)為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）

6、接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長(zhǎng)狀態(tài)。 正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時(shí)間觀察一次，觀察的容包括細(xì)胞是否生長(zhǎng)良好，形態(tài)是否正常，有無(wú)污染，培養(yǎng)基的 PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示） ，此外對(duì)培養(yǎng)溫度和 CO2濃度也要定時(shí)檢查。 原代培養(yǎng)一般有一段潛伏期（數(shù)小時(shí)到數(shù)十天不等） ，在潛伏期細(xì)胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過(guò)了潛伏期后細(xì)胞進(jìn)入旺盛的分裂生長(zhǎng)期。 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)， 將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱(chēng)為“一代” 。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無(wú)限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能具

7、有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性（Immortality）而無(wú)惡性。 四、凍存與復(fù)（可參閱后面有關(guān)章節(jié)）為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度196，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無(wú)限的。復(fù)一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入 37水中，使之在一分鐘迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。 凍存過(guò)程中保護(hù)劑的選用、細(xì)胞密度、降溫速度與復(fù)時(shí)溫度、融化速度等都對(duì)細(xì)胞活力有影響。 五、常用儀器設(shè)備 無(wú)菌室,超凈工作臺(tái),三重純

8、水蒸餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)器具，CO2培養(yǎng)箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機(jī),無(wú)菌過(guò)濾器,洗刷裝置,細(xì)胞計(jì)數(shù)板和電子細(xì)胞技術(shù)儀等等。 第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)菌環(huán)境 一、無(wú)菌室 無(wú)菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。 無(wú)菌室的消毒和防污染：為保持無(wú)菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（12 小時(shí)） ，每周甲醛、乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸（2 小時(shí)）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。實(shí)際工作中，要根據(jù)無(wú)菌室建筑材料的差異來(lái)選擇合適的消毒方法。 此外， 還應(yīng)注意防止無(wú)菌室的污染。 造成無(wú)菌室污染的可能包括： 送入無(wú)菌室的風(fēng)沒(méi)有被過(guò)濾

9、除菌； 進(jìn)出無(wú)菌室時(shí)，能使外界空氣直接對(duì)流進(jìn)無(wú)菌室的操作間；等。 二、超凈工作臺(tái) 工作原理：鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過(guò)高效過(guò)濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過(guò)臺(tái)面空間而將其中的塵埃、細(xì)菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。根據(jù)氣流在超凈工作臺(tái)的流動(dòng)方向不同，可將超凈工作臺(tái)分為側(cè)流式、直 流式和外流式三種類(lèi)型。 超凈臺(tái)的使用與保養(yǎng)：超凈臺(tái)的平均風(fēng)速保持在0.32-0.48 米/秒為宜，過(guò)大、過(guò)小均不利于保持凈化度；使用前最好開(kāi)啟超凈臺(tái)紫外燈照射 1030 分鐘， 然后讓超凈臺(tái)預(yù)工作1015 分鐘， 以除去臭氧和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)；使用完畢后，要用 70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)四周擦拭干凈，以保證超凈

10、臺(tái)無(wú)菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺(tái)。 第四節(jié) 常用培養(yǎng)器皿與清洗消毒 細(xì)胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類(lèi)、紙類(lèi)等，因此掌握清洗、消毒知識(shí)，學(xué)會(huì)清洗、消毒方法是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作必須的。 一、清洗 離體條件下，有害物質(zhì)直接同細(xì)胞接觸，細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)十分敏感，極少殘留物都可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認(rèn)真清洗，達(dá)到不含任何殘留物的要求。 （一）玻璃器皿的清洗 一般經(jīng)過(guò)浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個(gè)步驟。 1 浸泡 新的或用過(guò)的玻璃器皿都要先用清水浸泡， 軟化和溶解附著物。 新玻璃器皿使用前得先用自來(lái)水簡(jiǎn)單刷洗，然后用5鹽酸浸泡過(guò)夜；用

11、過(guò)的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。 2 刷洗 將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。 3 浸酸 浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱(chēng)酸液，通過(guò)酸液的強(qiáng)氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應(yīng)少于六小時(shí)，一般過(guò)夜或更長(zhǎng)。放取器皿要小心。 4 沖洗 刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細(xì)胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復(fù)“注水倒空”15 次以上，最后用重蒸水浸洗 23 次，晾干或烘干后包裝備用

12、。 （二）橡膠制品清洗 新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/L NaOH煮沸15 分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15 分鐘，流水沖洗，自來(lái)水煮沸2 次，蒸餾水煮沸 20分鐘，50烤干備用。 （三）塑料制品的清洗 塑料制品特點(diǎn)：質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強(qiáng)、但不耐熱。 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來(lái)水過(guò)夜，用紗布或棉簽和 50清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15 分鐘，流水沖洗（1520 遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24 小時(shí)，晾干備用。 （四）包裝:對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)用品進(jìn)行消毒前，要進(jìn)行嚴(yán)密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸 紙、棉布、鋁飯盒、

13、較大培養(yǎng)皿等，近幾年用鋁箔包裝，非常方便，適用。培養(yǎng)皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒，較大的器皿可以進(jìn)行局部包扎。 二、消毒和滅菌 微生物污染是造成細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因 （一）物理消毒法 1.紫外線消毒 紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。革蘭陰性菌最為敏感，其次是陽(yáng)性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力最強(qiáng)。紫外線的直接作用是通過(guò)破壞微生物的核酸與蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過(guò)紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡(jiǎn)單，效果好。 紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強(qiáng)度和照射劑量呈正相關(guān)， 輻射強(qiáng)度隨燈距離增加而降低， 照射劑量和照射時(shí)間呈正比。因此紫

14、外燈同被照射物的距離和照射時(shí)間要適合。離地面 2 米的 30W 燈可照射 9 平方米房間，每天照射23 小時(shí)，期間可間隔 30 分鐘。燈管離地面 2 米以外要延長(zhǎng)照射時(shí)間，2.5 米照射效果較差。紫外燈照射工作臺(tái)的距離不應(yīng)超過(guò) 1.5 米，照射時(shí)間30 分鐘為宜。 紫外燈不僅對(duì)皮膚、眼睛傷害，且對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開(kāi)著紫外等操作。 2.高溫濕熱滅菌 壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對(duì)生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類(lèi)、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。 不同壓力蒸汽所達(dá)到的溫度不同， 不同消毒物品所需的有效消毒壓

15、力和時(shí)間不同。 從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體） ，應(yīng)立即放到 60-70烤箱烘干，再貯存?zhèn)溆?，否則，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡(jiǎn)單、使用方便等特點(diǎn)。 3.高溫干熱消毒 干熱滅菌主要是將電熱烤箱物品加熱到160以上，并保持 90120 分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶） 、金屬器皿以與不能與蒸汽接觸的物品（如粉劑、油劑） 。 干熱滅菌后要關(guān)掉開(kāi)關(guān)并使物品逐漸冷卻后在打開(kāi)，切忌立即打開(kāi)，以免溫度驟變而使箱的玻璃器皿破裂。干烤箱物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。 燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺(tái)面上的酒精燈的火焰對(duì)金屬器皿與玻璃器皿口緣進(jìn)行燒灼消毒。 4.過(guò)濾除菌：是將液體或氣體用微孔薄膜過(guò)濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。在體外培養(yǎng)時(shí)，過(guò)濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。目前，大多實(shí)驗(yàn)室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜與無(wú)菌過(guò)濾過(guò)程。 （二）化學(xué)消毒：新潔而滅，其0.1水溶液