中藥合劑對缺氧性腦損害的抗氧化保護作用

1、中藥合劑對缺氧性腦損害的抗氧化保護作用        作者：肖峰， 姜正林， 李霞， 陳建， 潘永進， 顧永健， 石中瑗【關(guān)鍵詞】 缺氧；,中藥合劑；,抗氧化；,谷胱甘肽過氧化物酶；,過氧化氫酶摘要：目的觀察中藥合劑對缺氧大鼠腦組織的抗氧化保護作用。方法中藥合劑的主要成分為丹參、當(dāng)歸、黨參、黃芪，生藥含量0.4 g/ml。以低壓艙減壓模擬缺氧，分別觀察低氧、常氧條件下中藥合劑對SD大鼠腦組織谷胱甘肽含量（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）和過氧化氫酶（CAT）活性的影響，并檢測不同濃度中藥合劑在體外的抗羥自

2、由基效力。結(jié)果低氧暴露動物腦組織GSH含量下降，GSHPX和CAT活性降低（P0.01）。使用中藥合劑后，GSH與GSHPX顯著提高。常氧狀態(tài)下，中藥合劑就可提高GSH含量與GSHPX活性。體外實驗顯示中藥合劑能直接清除H2O2/Co2 體系中產(chǎn)生的羥自由基。結(jié)論 在該實驗條件下，中藥合劑對大鼠缺氧腦組織有一定的抗氧化神經(jīng)保護作用。藥物的這種作用與其提高機體自身的抗氧化能力以及其直接的清除自由基作用有關(guān)。關(guān)鍵詞：缺氧； 中藥合劑； 抗氧化； 谷胱甘肽過氧化物酶； 過氧化氫酶Anti-oxidative Protective Effect of Chinese Herbal Mixture on

3、 Hypoxic Rat BrainAbstract：ObjectiveTo observe the effect of Chinese herbal mixture against hypoxic brain in rats. MethodsHypoxic state was established in hypobaric chamber. We investigated the effects of Chinese herbal mixture on content of GSH, activities of GSH-PX and CAT of rat brain in both hyp

4、oxic and normoxic states. In another experiment, the hydroxyl radical scavenging activity of above mixture was measured in vitro using alizarin violet spectrophotometry.ResultsContent of GSH and activities of GSHPX and CAT all decreased significantly in hypoxic group, but GSH and GSHPX decreased les

5、s with pretreatment of Chinese herbal mixture. In normoxic state, GSH and GSH-PX were elevated with Chinese herbal mixture. In addition, Chinese herbal mixture scavenged hydroxyl radical in in vitro H2O2/Co2 experimental system in a dosedependent manner. ConclusionThe results suggest the mechanisms

6、are related to the Chinese herbal mixture of this study plays an antioxidative neuroprotective role on rat brain exposed to hypoxia, and that elevation of the activity of anti-oxidative enzyme GSHPX and the content of GSH, and a direct free radical-scavenging effect.Key wordsHypoxia; Chinese herbal

7、mixture; Anti-oxidation; GSH-PX; Catalaze    近年的實驗研究認為實施神經(jīng)保護是預(yù)防和治療缺氧腦損傷的有效措施，尤其是抗氧化藥物的研制和應(yīng)用已成為神經(jīng)元損傷防治研究的熱點之一。國內(nèi)外研制的許多西藥神經(jīng)保護劑由于具有一定的毒副作用，臨床應(yīng)用受到局限1。我國傳統(tǒng)中藥抗缺氧作用的研究表明，中藥具有作用溫和、保護作用和神經(jīng)細胞損傷的多樣性相一致的特點，但目前研究限于單味藥的較多，對復(fù)方制劑抗氧化、清除自由基能力的報道不多。對丹參、當(dāng)歸、黨參、黃芪等中藥的研究表明，它們均具有提高機體對缺氧的耐受性，清除氧自由基，降低血黏度

8、，改善微循環(huán)等多種功能2,3。我們運用建立的低壓低氧模型，觀察預(yù)先給予上述藥物制成的合劑對缺氧腦損害的抗氧化保護作用及在體內(nèi)、體外的抗自由基的能力，并分析其可能的作用機理，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。1 材料和方法1.1 材料 SD大鼠40只，其中用于缺氧研究的24只，由南通大學(xué)實驗動物中心提供，體重(240±20) g，分為常氧組（雄性5只，雌性4只）、低氧組（8只，雌雄各半）、中藥合劑組（雄性4只，雌性3只）；用于常氧狀態(tài)研究16只，購于上海復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部，體重(230±20) g，分成對照組和中藥合劑組，每組8只，均雌雄各半。中藥合劑由上海交通大學(xué)海洋水下工程科學(xué)

9、研究院提供，主要成分為丹參、當(dāng)歸、黨參、黃芪，生藥含量0.4 g/ml。GSH，GSHPX，CAT試劑盒購自南京建成生物工程研究所。茜素紫（C20H12O7）Chroma公司生產(chǎn)，上海化學(xué)試劑站分裝廠分裝，其他試劑均為國產(chǎn)AR級。1.2 方法 1.2.1 給藥方法中藥合劑組均于實驗（缺氧）前48，24，1 h腹腔內(nèi)注射（i.p.）給藥，用量：1 ml/200 gwt。其余兩組注射等量的生理鹽水。1.2.2 低氧暴露將中藥合劑組和低氧組動物放入低壓艙內(nèi)（艙容積為0.01 m3），關(guān)閉艙門，調(diào)整艙內(nèi)壓力，在1 h內(nèi)分3階段將壓力減至相當(dāng)于海拔8 040 m高度的空氣壓力（03 1306 0808

10、040 m）；在中間兩階段分別停留10及15 min，保持8 040 m高度的壓力5 h后加壓出艙，加壓時間10 min。常氧組作為實驗對照在艙邊常壓環(huán)境下停留6 h。1.2.3 樣本制備中藥合劑組和低氧組出艙后與常氧組動物一起迅速斷頭，取左側(cè)腦組織，在04的冰冷生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重（約100130 mg），加9倍量的04生理鹽水，在冰水浴中用玻璃勻漿器制成10腦勻漿，用離心機3 000 r/min，離心15 min，吸取上清液備測。常氧實驗的對照組和中藥合劑組動物腦勻漿的制備于最后一次給藥后1 h進行。1.3 檢測指標(biāo) GSH，GSHPX，CAT 3種指標(biāo)的測定均依試劑盒

11、說明書按步操作。Folin酚法測定腦勻漿的蛋白含量。利用改良茜素紫光度法檢測H2O2/Co2 體系產(chǎn)生的羥自由基，測定中藥合劑對羥自由基的清除率4。測定時按文獻5每個藥物濃度作3個平行樣，計算其平均值。1.4 統(tǒng)計學(xué)處理腦勻漿的GSH，GSHPX，CAT測定結(jié)果用(±s)表示，用Stata6.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用單因素方差分析，兩兩比較用Scheffe法。羥自由基清除率的數(shù)據(jù)采用非線性回歸的Four parameter logistic standard curve模擬，按下式計算EC50：y = min (max - min) / (1 (x / EC50)Hill

12、slope)。2 結(jié)果2.1 中藥合劑對缺氧處理后腦勻漿GSH，GSH-PX，CAT的影響結(jié)果見表1。表1 中藥合劑對大鼠缺氧處理后腦組織GSH，GSH-PX，CAT的影響（略）與常氧組比較，P0.01；與低氧組比較，*P0.05；#P0.01表1顯示，大鼠經(jīng)低氧暴露后，腦組織GSH含量,GSH-PX和CAT活力3項指標(biāo)均明顯降低（P0.01）。預(yù)先使用中藥合劑后，再經(jīng)低氧暴露，此時三項指標(biāo)均有所回升，與低氧組比較GSH與GSH-PX的改變有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05或P0.01），但與常氧組比較降低仍很明顯（P0.01）。結(jié)果表明中藥合劑有一定的抗氧化神經(jīng)保護作用。2.2 中藥合劑對常氧狀態(tài)下腦

13、勻漿GSH，GSH-PX，CAT的影響結(jié)果見表2。表2 中藥合劑對常氧狀態(tài)下腦組織GSH，GSH-PX，CAT的影響（略）與生理鹽水組比較，*P0.05,*P0.01;n=8表2顯示，與生理鹽水組比較，中藥合劑組GSH，GSH-PX，CAT都有所升高，僅GSH，GSH-PX的改變有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05或P0.01）。表明常氧狀態(tài)下，中藥合劑能提高腦組織的GSH水平和GSH-PX活力，增強腦組織的抗氧化能力。2.3 中藥合劑在體外抗羥自由基的作用結(jié)果見圖1。如圖1所示，中藥合劑在體外對羥自由基的清除率和藥物濃度有明顯的量-效關(guān)系，即濃度越大，清除效果越佳，但達到一定的濃度后即趨向飽和。根據(jù)計算

14、，清除反應(yīng)體系中50%的羥自由基，中藥合劑的濃度(EC50)為：0.07 ml/10 ml，折合生藥濃度為2.8 mg/ml。圖1 羥自由基的清除率與藥物濃度量-效關(guān)系（略）3 討論研究表明缺氧腦損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能紊亂、細胞內(nèi)鈣超載、一氧化氮及自由基的神經(jīng)毒性及炎性損害等機制。其中自由基急劇增高是缺氧時的重要病理生理基礎(chǔ)6。正常情況下，人體內(nèi)自由基不斷產(chǎn)生，又不斷被清除。腦缺氧時，機體內(nèi)存在的氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，形成惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致自由基在體內(nèi)的大量堆積。清除自由基、抗氧化制劑可分為酶類自由基清除劑和非酶類自由基清除劑兩大類。酶類自由基清除劑主要有超氧化

15、物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）。本文結(jié)果顯示，缺氧導(dǎo)致腦勻漿中GSH-PX ，CAT活性及GSH含量下降，表明腦組織內(nèi)抗氧化體系的抗氧化能力降低，而中藥合劑能明顯地降低缺氧時GSH含量和GSH-PX活力的下降程度，提高腦組織的抗氧化能力，有助于減輕腦缺氧損傷狀況。通過進一步實驗，我們發(fā)現(xiàn)中藥合劑在正常狀態(tài)下，亦能提高腦組織的GSH-PX 活性和GSH含量。并且，體外抗羥自由基實驗顯示，中藥合劑還具有直接的清除羥自由基的作用，且具有劑量依賴關(guān)系。這些結(jié)果表明，腦缺氧時若使用中藥合劑具有抗缺氧神經(jīng)保護作用，這一藥效可能與組方中的藥物提高機體抗氧化酶的活

16、力，以及自身就具有的清除氧自由基的作用有關(guān)。GSH具有重要的生理功能，它能通過GSH-PX還原體內(nèi)不斷生成的脂質(zhì)過氧化物和過氧化氫，以消除它們對酶和膜蛋白上巰基的氧化作用，維持細胞及組織的正常功能及代謝7，而反應(yīng)中生成的GSSG可以經(jīng)谷胱甘肽還原酶所催化，利用磷酸戊糖旁路所生成的還原型輔酶（NADPH）重新還原成GSH缺氧時，由于過氧化物生成的速度大大超過細胞內(nèi)NADPH的生成速度，使得GSH/GSSG的比值下降，并導(dǎo)致GSH-PX活性下降造成氧化應(yīng)激，而GSH-PX是一種含硒的酶，在腦中含量高，和超氧化物歧化酶(SOD)協(xié)同處理自由基的過程中起主要作用，是主要的H2O2清除酶8，可清除線粒體

17、和胞質(zhì)中產(chǎn)生的H2O2，從而防止羥自由基(OH)的產(chǎn)生。羥自由基的化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，被認為是對生物體危害最大的自由基9，它和自由基清除劑及組織發(fā)生反應(yīng)的能力都很強，這樣，很高濃度的自由基清除劑才能有效果。實際上，自由基清除劑在很高濃度時，往往產(chǎn)生明顯的副作用，這限制了許多藥物的應(yīng)用10，但中藥有很大的優(yōu)越性，其作用溫和，并且作用環(huán)節(jié)多，各環(huán)節(jié)之間可能還會產(chǎn)生協(xié)同作用。綜上所述，在本實驗條件下，中藥合劑對大鼠缺氧腦組織有一定的抗氧化神經(jīng)保護作用，這種作用與藥物提高機體自身的抗氧化能力及其直接的清除自由基作用有關(guān)。本研究為這一中藥合劑用于抗缺氧腦損傷提供了重要的參考依據(jù)。參考文獻：1 Chauha

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