地錦草總黃酮預(yù)防四氯化碳所致急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究(一)

1、地錦草總黃酮預(yù)防四氯化碳所致急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究(一)作者：曹瑞珍， 魏永春， 強(qiáng)欣， 喬偉【關(guān)鍵詞】 地錦草；,總黃酮；,急性肝損傷；,四氯化碳摘要：目的研究地錦草總黃酮(total flavonoids of Euphorbiae humifusae，TFEH) 對(duì)四氯化碳造成的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法四氯化碳造成小鼠急性肝損傷模型,測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(serum glutamic pyruvic transaminase,SGPT)、肝組織谷丙轉(zhuǎn)氨酶(liver glutamic pyruvic transaminase,GPT)、超氧化物歧化酶(superoxidase dism

2、utase,SOD)活性及丙二醛(malonaldehyde,MDA)、還原性谷胱甘肽（GSH）含量,采用光鏡觀察肝臟組織學(xué)變化。結(jié)果與四氯化碳模型組比較,經(jīng)TFEH預(yù)防性治療后,GPT、LGPT活性和MDA含量均明顯降低(P0.05或P0.01),而GSH含量和SOD活力明顯增高(P0.05)。通過病理學(xué)切片觀察,TFEH明顯改善肝組織的病理變化。結(jié)論TFEH對(duì)四氯化碳造成的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：地錦草； 總黃酮； 急性肝損傷； 四氯化碳Protective Effect of Total Flavonoids of Herba Euphorbiae humifusae aga

3、inst Hepatic Injury Induced by CCl4 in MiceAbstract：ObjectiveThe protective effect of total flavonoids Euphorbiae humifusae against CCl4-induced hepatic injury in mice was observed. MethodsAcute liver injury model in mice was made by using CCl4. The levels of SGPT, LGPT in serum and MDA, SOD,GSH in

4、liver and hepatic pathological tissue were observed. ResultsCompared with model control group, the levels of serum SGPT, LGPT, liver MDA of the mice treated with TFEH significantly decreased(P0.05 or P0.01),while the activity of SOD and the level of GSH increased greatly(P0.05). By observation of pa

5、thological slices, TFEH could improve hepatic pathological changes distinctly. ConclusionTFEH can prevent CCl4-induced hepatic injury.Key words：Herba Euphorbiae humifusae; Total flavonoids; Acute liver injury; Carbon tetrachloride地錦草為常用的中蒙藥材，具有清熱解毒、燥濕、活血等功效1，2，通過現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)地錦草主要含有槲皮素及其苷、山奈素及其苷等黃酮類化合物3

6、。文獻(xiàn)報(bào)道地錦草治療病毒性肝炎取得療效4；本課題組前期研究了TFEH藥理學(xué)活性5，6，發(fā)現(xiàn)其水及乙醇提取物具有良好的抗脂質(zhì)過氧化等作用。在此基礎(chǔ)上,我們研究了TFEH對(duì)四氯化碳造成的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用,并探討其可能作用機(jī)制及其應(yīng)用前景。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動(dòng)物純系昆明種小鼠50只，體重 (252) g，雌雄各半,由錦州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度2225,濕度70%。1.1.2 藥品與試劑地錦草購于內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室，由蒙藥系布和巴特教授鑒定。測(cè)定試劑盒均來自南京建成生物工程研究所。1.1.3 儀器7230分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠),光學(xué)分

7、析天平、FA160電子天平（上海天平儀器廠),IGL-16臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠)。1.2 方法1.2.1 藥物配制取地錦草粗粉（20目）150 g加75%乙醇900 ml，浸泡12 h，回流提取1.5 h，提取3次，合并提取液，回收乙醇，加蒸餾水溶解并定容至400 ml，配成1 ml含生藥0.375 g，黃酮含量為16.7 mg/ml(經(jīng)蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙藥分析化學(xué)教研室檢測(cè))，再21稀釋成0.25 g生藥/ml，以此作為高劑量組的給藥濃度。再配制低劑量組的給藥濃度0.125 g生藥/ml。1.2.2 動(dòng)物分組及給藥方法小鼠40只,按隨機(jī)數(shù)字表法分為4

8、組,每組10只:組為正常對(duì)照組, 每次1ml蒸餾水灌胃;組為模型對(duì)照組,灌胃等容積常用水;、組分別為TFEH高、低劑量治療組, 1次/d，1 ml/次，濃度分別為0.25 g生藥/ml，0.125 g生藥/ml；上述各組均給藥1次/d,連續(xù)1周。末次給藥后,組小鼠按10 ml/kg腹腔注射0.15%四氯化碳豆油溶液1次,建立急性肝損傷模型。注射四氯化碳后禁食20 h,斷頭取血,離心得血清,并快速取肝臟,取肝左葉組織約0.5 g,在冰冷的生理鹽水中漂洗,濾紙拭干,以生理鹽水用組織勻漿器制成10%肝組織勻漿,離心,取上清液,準(zhǔn)備檢測(cè)各指標(biāo)。1.2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)血液及肝檢測(cè)指標(biāo):SGPT，LGP

9、T，MDA，SOD和GSH,按試劑盒要求進(jìn)行測(cè)定。1.2.4 病理學(xué)檢查取部分肝右葉組織做病理學(xué)檢查,將其放于10%甲醛溶液中,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 s表示,采用t檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 急性肝損傷小鼠生化指標(biāo)檢測(cè)由表1可以看出, 與模型組比較TFEH能顯著降低血清和肝臟GPT活力(P0.01);由表2可以看出,與模型組相比較,TFEH能明顯降低MDA的含量(P0.05),還能明顯提高SOD活性(P0.05),高低劑量之間沒有顯著性差異;同時(shí),TFEH能增加肝臟GSH的含量,與模型組比較,高劑量組有明顯差異(P0.05)。表1 TFEH對(duì)急性肝損傷

10、小鼠SGPT,LGPT的影響（略）與正常對(duì)照組比較,P0.01;與模型對(duì)照組比較，#P0.05,#P0.01；n=10表2 TFEH對(duì)急性肝損傷小鼠MDA、SOD和GSH的影響（略）與正常對(duì)照組比較， P0.05,P0.01;與模型對(duì)照組比較，#P0.05；n=102.2 急性肝損傷小鼠肝臟病理學(xué)改變正常對(duì)照組小鼠肝臟外觀呈紅褐色,質(zhì)地軟而富有彈性; 鏡下見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞排列整齊,大小均勻,分界清楚,細(xì)胞核位于細(xì)胞中央,圓而清晰（見圖1）；模型對(duì)照組小鼠肝臟體積增大,質(zhì)脆,邊緣鈍而厚,表面呈黃褐色; 鏡下可見肝細(xì)胞水腫及小葉中心區(qū)肝細(xì)胞壞死,壞死的肝細(xì)胞發(fā)生核固縮、碎裂及溶解，致肝細(xì)胞索

11、分離（見圖2）；TFEH高、低劑量組肝臟略有水腫,質(zhì)地柔軟; 鏡下見肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整,細(xì)胞排列較整齊,肝細(xì)胞輕度水腫，小葉中央?yún)^(qū)散在少許點(diǎn)狀壞死灶，淋巴細(xì)胞浸潤，變性、壞死較模型組顯著改善,且高劑量組比低劑量組的更輕一些（見圖34）。圖1 正常對(duì)照組肝組織 HE染色100 （略） 圖2 模型對(duì)照組肝組織 HE染色100 （略） 圖3 低TFEH組肝組織 HE染色100 （略） 圖4 高TFEH組肝組織 HE染色100 （略） 3 討論肝病是一種發(fā)病率高、難以根治的疾病,對(duì)人類健康危害極大,而且不良的飲食習(xí)慣、藥物、毒物等均能導(dǎo)致肝臟疾病,損害肝細(xì)胞。大量研究表明,在肝細(xì)胞病變過程中,自由基、

12、酶以及脂質(zhì)過氧化等均發(fā)揮重要作用。四氯化碳致小鼠肝損傷模型,一直被廣大學(xué)者所應(yīng)用,其機(jī)制為:四氯化碳在肝內(nèi)經(jīng)微粒體細(xì)胞色素P450分解活化,形成三氯甲基自由基(CCl3?)和氯自由基(Cl?),導(dǎo)致肝微粒體的脂質(zhì)過氧化7。由于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)而抗氧化能力下降,導(dǎo)致自由基生成增加,通過過氧化細(xì)胞膜脂質(zhì),使肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受到損害8。文獻(xiàn)9報(bào)道化合物中的酚羥基是抗脂質(zhì)過氧化作用的功能基團(tuán),地錦草所含黃酮類化合物槲皮素及其苷、山奈素及其苷等,含有酚羥基結(jié)構(gòu)基團(tuán),因而發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有保肝護(hù)肝作用。實(shí)驗(yàn)顯示,TFEH能顯著降低血清和肝臟GPT活力(P0.01),從而減少丙酮酸生成,使還原型NADP

13、H含量增高,以此增強(qiáng)肝細(xì)胞抗氧化、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化的能力。TFEH還明顯降低MDA含量(P0.05),增加GSH含量,是由于所含酚羥基的抗脂質(zhì)過氧化作用,直接捕捉、清除自由基,生成自由基中間體,阻斷或終止自由基連鎖反應(yīng)鏈,從而阻止或抑制氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng),最終抑制脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的生成,減輕肝臟還原型GSH的耗竭10，但GSH含量增加不明顯,與模型組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TFEH同時(shí)明顯提高肝臟SOD活力(P0.05),這與黃酮類化合物參與調(diào)節(jié)和提高體內(nèi)抗氧化酶的活性有關(guān)11。病理學(xué)檢查表明,TFEH能明顯預(yù)防急性肝損傷,減輕肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷,提示TFEH具有保護(hù)損

14、傷肝細(xì)胞的作用。參考文獻(xiàn)：1 中國醫(yī)學(xué)百科全書編輯委員會(huì).中國醫(yī)學(xué)百科全書蒙醫(yī)學(xué)M.上海：上?？萍汲霭嫔?，1992：227.2 馬清鈞.常用中藥現(xiàn)代研究與臨床 M.天津：天津科技翻譯出版社，1995：166.3 柳潤輝.地錦草化學(xué)成分的研究J.中草藥，2001，32（2）：107.4 汪仁柏.地錦草治療病毒性肝炎65例臨床觀察J.中國農(nóng)村醫(yī)學(xué)，1987，（3）：12.5 曹瑞珍.大戟科植物地錦草的藥效學(xué)研究探討J.中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，21（6）：892.6 曹瑞珍，魏永春，佘集凱，等.地錦草提取物對(duì)小鼠血液SOD和MDA的影響J.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，17（4）：342.7 辛 念，熊建新，韓淑英，等.蕎麥種子總黃酮對(duì)四氯化碳所致急性肝損傷的保護(hù)作用J.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（14）：1456.8 RouachH,FataccioliV,GentilM,etal.Effect of chronice than olfeeding on lipid peroxid ationand protein oxidation inrelationtoliverpathologyJ.Hepatology,1997,25(2):