基于圖像分析的DNA定量分析研究

1、基于圖像分析的DNA定量分析研究            基于圖像分析的DNA定量分析研究    2008-6-3 12:37:34                          

2、;                       【關(guān)鍵詞】  DNA摘要：目的運(yùn)用ICM（Image Cytometer）對(duì)圖像進(jìn)行處理和分析，在給出細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)的同時(shí)對(duì)DNA的含量進(jìn)行定量分析，能有效地協(xié)助醫(yī)生對(duì)諸如腫瘤等多種病癥做出診斷。方法以        基于圖像分析的DNA定量

3、分析研究    2008-6-3 12:37:34                                          

4、60;      1  材料與方法1.1  材料宮頸脫落細(xì)胞樣本取自湖北省武漢市腫瘤醫(yī)院、湖北省黃石市第一醫(yī)院和山東淄博計(jì)劃生育研究所，保存于50%的乙醇溶液（細(xì)胞保存液）中。雞血紅細(xì)胞取自健康公雞的動(dòng)脈血，加入0.3%0.4%的檸檬酸鈉抗凝劑，保存于50%的乙醇溶液（細(xì)胞保存液）中。1.2  方法采用液基薄層制片技術(shù)，對(duì)制作的玻片進(jìn)行Feulgen染色，再利用全自動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量分析儀完成對(duì)細(xì)胞圖像的采集、處理和DNA定量分析。1.2.1  液基薄層制片 在細(xì)胞保存液中加入0.1%DTT消化液放在振

5、蕩器上振蕩2 h,然后將消化后的細(xì)胞懸液離心5 min(800 r/min)，棄上清液后加入50%乙醇分別清洗、離心2次(800 r/min×5 min/次)。然后將用保存液稀釋的細(xì)胞混懸液放入細(xì)胞涂片離心機(jī)甩片5 min,制成薄層細(xì)胞學(xué)玻片14 。1.2.2  Feulgen染色  固定液：10%緩沖福爾馬林液（pH 7 .4）；酸解液：鹽酸，濃度5mol/L；酸解溫度：25(與武漢四五月份室內(nèi)溫度基本接近)；酸解時(shí)間： 45 min；測(cè)量濾色鏡波長：560 nm。染色過程： 涂片空氣干燥1 h，固定液固定1 h；蒸餾水漂洗10 min；5 mol/L HCl，

6、25酸解45 min，(溫控水浴)；蒸餾水漂洗5 min；與Schiff染液反應(yīng)45 min (25)；蒸餾水漂洗5 min；自來水沖洗15 min (穩(wěn)水)，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封固15，16  。1.2.3  DNA定量分析 全自動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量分析儀的系統(tǒng)構(gòu)成及分析流程  ：武漢大學(xué)光譜與成像儀器工程技術(shù)研究中心自主開發(fā)的全自動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量分析儀硬件系統(tǒng)由Olympus BX41顯微鏡、恒流源、自動(dòng)上下片系統(tǒng)、精確位移三維平臺(tái)(包括載物臺(tái)、步進(jìn)電機(jī)、三軸原點(diǎn)定位傳感器、條碼掃描器等)、CCD攝像機(jī)、操縱桿、控制器和、計(jì)算機(jī)等組成（見圖1）

7、。軟件系統(tǒng)自動(dòng)聚焦、掃描、圖像采集程序(盧國強(qiáng). ICM分析自動(dòng)化及應(yīng)用研究.武漢大學(xué)碩士學(xué)位論文)，細(xì)胞圖像數(shù)據(jù)庫、細(xì)胞特征庫、知識(shí)模型庫和智能分析處理程序(張燕. 遺傳算法和支持向量機(jī)在DNA細(xì)胞圖像分析儀中的應(yīng)用.武漢大學(xué)碩士學(xué)位論文)，六大功能模塊構(gòu)成。分析流程如圖2所示。圖1  全自動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量分析儀硬件構(gòu)成 （略）圖2  DNA定量分析的流程（略）扣背底算法 ：為了克服光學(xué)傳遞中的不均勻性，我們采集了一幅空視野作為亮場(chǎng)背底圖像，然后在后面采集的細(xì)胞圖像中除去這個(gè)背底圖像，用這種方法可以有效地減少視場(chǎng)不勻帶來的誤差。全局扣背底為測(cè)量細(xì)胞圖像分析儀的光均勻度

8、，在玻片上尋找一個(gè)空白位置（染色后的背底，一般還會(huì)有少量的雜質(zhì)）采集一幅背底圖像，背底圖像的灰度分布不均勻（見圖3），其灰度直方圖也不是規(guī)則的單峰，這是與顯微鏡的光路系統(tǒng)直接相關(guān)的，如果不采用軟件系統(tǒng)進(jìn)行校正，會(huì)帶來極大的測(cè)量誤差。均勻度指背景光強(qiáng)的灰度標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（coefficient of variation）。它們描述了背景光的均勻性，要求背景圖像的像素點(diǎn)灰度變異系數(shù)小于3%。其公式如下：sd=1     MNM     i=1N     j=1fij(x,y)-

9、     f(x,y)21/2         （1）CV=sd          f(x,y)    其中sd為圖像各個(gè)像素灰度的標(biāo)準(zhǔn)差，fij(，y) 為某一個(gè)像素點(diǎn)的灰度值（0255），     f(x,y)為圖像所有像素灰度的平均值， M，N分別是圖像的長和寬。 cv為圖像各個(gè)像素灰度的變異系數(shù)。圖3  采集的

10、背底圖像 （略）     圖4  背底圖像分割效果圖 （略）   圖5  變異系數(shù)（略）由圖4可見，由于背底圖像的灰度分布不均勻，二值化后的圖像存在不規(guī)則邊緣（圖中藍(lán)色表示背景中灰度值較小的區(qū)域）。圖5中，其直方圖的第1個(gè)峰為某處視場(chǎng)進(jìn)行扣背底后計(jì)算的像素點(diǎn)灰度值變異系數(shù)（1.08%），第2個(gè)峰為未扣背底計(jì)算的變異系數(shù)（3.82%），第3個(gè)峰為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的變異系數(shù)最大值（3%）?？鄢植勘车椎姆椒ㄅc全局扣背底類似。一般是將細(xì)胞的外接矩形擴(kuò)展2個(gè)像素，然后在此范圍內(nèi)計(jì)算除了細(xì)胞的有效像素之外的所有背景像素的灰度平均值，

11、并以此平均值作為平均背底在細(xì)胞的每個(gè)有效像素中扣除?？鄢惴梢杂孟喑蛳鄿p（本DNAICM程序中用相除）。由于雞血紅細(xì)胞比宮頸脫落細(xì)胞小得多，且有的細(xì)胞連接較緊密，采用將細(xì)胞的外接矩形擴(kuò)展2個(gè)像素的方法會(huì)使外擴(kuò)區(qū)域中包含其他雞血紅細(xì)胞的有效像素，從而在計(jì)算積分光密度時(shí)產(chǎn)生誤差，所以采用外擴(kuò)1個(gè)像素的方法。    3 4               基于圖像分析的DNA定量分析研究   

12、 2008-6-3 12:37:34                                              &

13、#160;  2  結(jié)果2.1  冷酸法Feulgen染色后的效果    20倍鏡下經(jīng)45 min酸解的雞血紅細(xì)胞在全自動(dòng)DNA細(xì)胞圖像定量分析儀中采集的圖像如圖68所示。由圖可見，細(xì)胞邊緣清晰，著色均勻，效果優(yōu)于熱酸法。圖6  原始細(xì)胞圖像（略）              圖7  背底圖像（cv=1.62%）（略）      

14、        圖8  全局扣背底后的圖像（略）2.2  20倍鏡下雞血紅細(xì)胞積分光密度直方圖的比較    20倍鏡下經(jīng)45 min酸解的雞血紅細(xì)胞（十個(gè)視場(chǎng)，共1500個(gè)細(xì)胞）分別按照下面四種不同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖9）。結(jié)果見表1。由表1可以得出：IOD離散程度全局扣背底加局部扣背底時(shí)最小。理想的玻片背底是均勻的，但實(shí)際上由于經(jīng)Feulgen染色后玻片上殘留染色物質(zhì)的分布不均和照明光源的不均勻性，使得玻片背底實(shí)際的灰度分布不均勻。如果不扣除這種不均勻性，在

15、玻片不同位置或者是視場(chǎng)的不同位置測(cè)得的相同細(xì)胞核的灰度值不同，計(jì)算出的IOD值也會(huì)受影響。而全局扣背底大體上去除了背景的不均勻性造成的影響。再進(jìn)行一次局部扣被底，把背景不均勻性的影響再次減小，所以此時(shí)得到的IOD的主峰緊密程度最好，離散程度最??；IOD方差各不相同，其中全局扣背底比不全局扣背底所得的方差要小。這也是由于全局扣背底大體上去除了背景的不均勻性造成的影響。表1  4種扣背底方法的比較（略）圖9  （略）（1）全局扣背底、局部扣背底后的細(xì)胞IOD直方圖；（2）全局不扣背底、局部扣背底后細(xì)胞IOD直方圖；（3）全局扣背底、局部扣背底后的細(xì)胞IOD直方圖；（4）全局不扣

16、底、局部不扣背底后的細(xì)胞IOD直方圖。坐標(biāo)系中橫坐標(biāo)表示IOD值，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞個(gè)數(shù)2.3  宮頸脫落細(xì)胞DI（DNA Index,DNA指數(shù)）直方圖、散點(diǎn)圖  20倍鏡下的正常人體宮頸細(xì)胞和發(fā)生癌變的人體宮頸細(xì)胞（全局扣背底、局部扣背底）DI直方圖、散點(diǎn)圖的比較（見圖10）。圖10 （略） （1）、（2）正常人體宮頸細(xì)胞直方圖和散點(diǎn)圖；（3）、（4）發(fā)生癌變的人體宮頸細(xì)胞直方圖和散點(diǎn)圖直方圖中橫坐標(biāo)表示DI值，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞個(gè)數(shù)；散點(diǎn)圖中橫坐標(biāo)表示DI值，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞核面積由于宮頸脫落細(xì)胞比雞血紅細(xì)胞大得多且DNA含量較穩(wěn)定，所以正常人體細(xì)胞IOD直方圖中IOD值的離散

17、程度更?。s90%的細(xì)胞在主峰的正負(fù)10%范圍內(nèi)），DI值的主峰更細(xì)，系統(tǒng)測(cè)量的結(jié)果更精確。由于發(fā)生癌變的細(xì)胞中DNA含量增加，DI值大于2的細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯增多，醫(yī)生可以根據(jù)DI值來判斷細(xì)胞的癌變程度并作出診斷。    3 4               基于圖像分析的DNA定量分析研究    2008-6-3 12:37:34    &#

18、160;                                            3  結(jié)論細(xì)胞DNA定量分析對(duì)從硬件平臺(tái)到軟件算法都有著極為嚴(yán)格

19、的要求，以保證定量分析的精度和診斷結(jié)果精確性。DNA定量分析的關(guān)鍵是對(duì)細(xì)胞的積分光密度和形態(tài)學(xué)參數(shù)（面積、形狀因子等）的準(zhǔn)確測(cè)量。其中第一步就是要獲取準(zhǔn)確、清晰的圖像，這就對(duì)細(xì)胞制片和染色環(huán)節(jié)提出了嚴(yán)格的要求。液基薄層制片技術(shù)的運(yùn)用，F(xiàn)eulgen染色中冷酸法的選擇保證了所制玻片完全滿足DNA定量分析的需要。在細(xì)胞積分光密度和形態(tài)學(xué)參數(shù)測(cè)量之前對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行扣背底處理，很好的消除了顯微鏡光路系統(tǒng)帶來的測(cè)量誤差，克服了光學(xué)傳遞中的不均勻性，使得細(xì)胞積分光密度的測(cè)定更加精確。參考文獻(xiàn)：  徐元. ICM技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景J.實(shí)用腫瘤雜志，1999 ，14（1）：3.  張

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