WB灰度值測(cè)定

1、Image J關(guān)丁用 Image J 重化 wester法，然鵝小伙伴們卻一直不確定到底 光密度弄混淆。今天咱們一起就這個(gè)機(jī), 灰度值？以下是兩種方法的具體操作。方率-:1、打開(kāi)Image J 軟件一左帶擺正）2、把圖片轉(zhuǎn)化成灰度圖片：3、A個(gè)矩形工具一選上所有條帶測(cè)到了 WB條帶灰度俏nblot條帶灰度值，在網(wǎng)上一直盛傳著兩種操作方那種才是正確的測(cè)量灰度方法，甚至將灰度與會(huì)學(xué)習(xí)卜，請(qǐng)先看看你是用以下那種方法測(cè)量:上角 file Open 選擇自己的條帶圖片（事先把條Image ftype - 8-bit（_L O U D _ 4、A A Q | 二/ 。，7 一 ：一 口DO口o4、 ana

2、lyze fGels f select fir開(kāi)選取，如：框選 A個(gè)條帶一z到余下條帶一 Gelsfselect nextlan5、選中直線工具，將開(kāi)口波峰關(guān)st lane f Gels - plot lanes（在這第四步也可以分analyze Gels 一 select firstlane 一將令-個(gè)框拖移e ）用1 u二4一+、1 A J d ，i <2<|/ 喬贊Fffl d 匚*一 1 人后口7 L-A KIlAP1 口Ajj 4.-J I IfIjJIrTi.工!1匕；V-I6、選中魔棒工具（正數(shù)第七個(gè)），點(diǎn)擊波峰，就得出所有area值。方法1、打開(kāi)Image J軟件一

3、左上角file 一Open選擇自己的條帶圖片（事先條帶弄正）2、把圖片轉(zhuǎn)化成灰度圖片：Image type - 8-bit3、扣除背景：Process Subtract Background - 50pixels 并勾選 LightBackground5、設(shè)定參數(shù)：Analyze fset measurement 勾選 Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density6、Analyze fset scale funit of length選項(xiàng)里改為pixels ,確定 Set ScwleDistance in pi

4、xels: 300Known distance： 1.0。Pixel aspect ratio: 1.0Unit of length: inchClick to Remove Scale GlobalScale: 300 ptxels/inchMHelp Cancel OK ）（心靈手6、圖像分割。Edit - Invert 一選中橢圓圈（手殘黨首選）/不規(guī)則圓圈巧黨義無(wú)反顧），手動(dòng)圈上單個(gè)條帶7、Analyze fMeasurement 即得到Intden,重復(fù) 6、7步就得到所有Intden 值RusultsAre Mein 網(wǎng)in lntD»n RawlctDenI 0.009

5、- 73.790 13135 0.641577Q4小伙伴們，你們是哪種方法呢？首先先把結(jié)論說(shuō)出來(lái)，其實(shí)兩者得出的Intden 嚴(yán)格來(lái)說(shuō)都不是灰度值，前者是面積而后者是光密度值，但用來(lái)量化area 和WB條帶都是OK的。Image J 這個(gè)軟件在將western blot條帶量化時(shí)存在兩種參數(shù)：灰度與光密度（假，暫且這么稱(chēng)呼，原因下文再說(shuō)），這兩者在理解使用Image J量化 WB條帶十分重要，請(qǐng)務(wù)必仔細(xì)看以下幾個(gè)概念。1、灰度（gray）:是指圖像中各種顏色的深淺程度，它以整數(shù)值表示，一般的圖像分析軟件將圖像每個(gè)像素點(diǎn)的顏色分為0-255 共256級(jí)，每一像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)的數(shù)值即灰度，灰度值越小物體

6、顏色越深。有興趣的小伙伴，可以隨意用Image J打開(kāi)一張圖片，光標(biāo)在圖片上任意移動(dòng)，得到的 value值最小為0 （純黑），最大為 255 （純 白）。imageJ2.53 (760), y = 1.22 (365), value=0七| A C | /value-2SS。0E309D2、光密度（OD ,真）：也就是吸光度（ A）,光線通過(guò)溶液或某一物質(zhì)前的入射光強(qiáng)度Io與該光線通過(guò)溶液或物質(zhì)后的出射光強(qiáng)度Ib比值的對(duì)數(shù) OD=lg （Io/Ib ）,其實(shí)就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比爾定律。入射光ToQ出射光Tb*明確這兩個(gè)概念后，我們?cè)賮?lái)看為什么稱(chēng)Image J里的光密度是“假”，因?yàn)?/p>

7、在圖像分析中的光密度（假）是由灰度值再經(jīng)計(jì)算得到的，它是一個(gè)相對(duì)值，但其算法與OD值的算法類(lèi)似。只是它白入射光強(qiáng)度由Western blot膠片上最亮區(qū)域的平均灰度值代替，而出射光強(qiáng)度則由待測(cè)目標(biāo)平均灰度值代替。即：圖像分析系統(tǒng)的光密度值=lg（WB 膠片上最亮區(qū)域的平均灰度值/待測(cè)目標(biāo)的平均灰度值），再簡(jiǎn)單點(diǎn)來(lái)說(shuō)，就是光密度（假）和正兒八經(jīng)的灰度值有血緣關(guān)系?？偨Y(jié)起來(lái)說(shuō)灰度與光密度（假）都能用來(lái)量化western blot條帶，兩種量化任君隨意挑?，F(xiàn)在說(shuō)回兩種操作方法：方法一：是通過(guò)每個(gè)條帶上眾多像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)的灰度值勾畫(huà)出一條曲線，最后魔棒點(diǎn)出算出的area值其實(shí)就是該條帶所對(duì)應(yīng)的面積大小。條

8、帶越大，area值越大。方法二：是通過(guò)上文說(shuō)到的光密度（假）計(jì)算方法得出來(lái)的，最后得出的Intden 值是所圈面積下的總光密度值，再除以圈下面積area ,得出的是平均光密度值（圖像中陽(yáng)性區(qū)域每一像素點(diǎn)的OD值疊加后除以測(cè)量的面積）。條帶（顏色反轉(zhuǎn)后）越白越亮則Intden/area 越大。所以嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō)，方法一方法二最后得出的數(shù)據(jù)都不屬于正兒八經(jīng)的灰度值，但又與灰度值有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。如果只是量化WB條帶，兩種方法是都能選用的，記得標(biāo)注你得到的結(jié)果是area還是Intden ，但如果你想測(cè)出真正的灰度值，那么我們下節(jié)課再來(lái)好好談?wù)?，咦？我說(shuō)話怎么越來(lái)越像老師的風(fēng)格呢，哈哈，同學(xué)們，下

9、課.今天主要講述如何用photoshop 測(cè)量 WB灰度值，在講述操作方法之余，小石頭先給大家理一理原理，以便大家更好的理解（文末附操作方法）。照例最先展示下最后的成果圖（其實(shí)最后可以用Graphpad 做圖，在此不贅述）：=A2-C2AB.CDE加魔片（平均ten面板巧承灰J度包，施拙度被型冽依總灰魔45.&?62711770.026991|45.5492 斜8062 2226632.2G36622Q10.02C99132,236691G479,5746S1123 39239a410.026991123 36S399103750.3006131 A10S5712S6002699113

10、1.783966170792,019917 1D6S2314590.02G991170.07S93224B14S,6208163 620371S120.026991163 593379247353 189條帚忌萩度30CO0Q1SXJOOOkooo1(KKX)C5COOC好了，開(kāi)始今天的課程，現(xiàn)在手里有張這樣的WB條帶圖，如何將各條帶灰度0值測(cè)量出來(lái)?首先我們從基本原理聊起，圖片大小的存儲(chǔ)基本單位是字節(jié)，每個(gè)字節(jié)是有8個(gè)比特（bit ,音譯為比特，也稱(chēng)為“位”）組成。一般的圖片都是由眾多像素點(diǎn)構(gòu)成的，灰度模式下一個(gè)像素一個(gè)字節(jié)，也同時(shí)就是 8bit。在上一堂課中，我們?cè)肐mageJ將圖片轉(zhuǎn)化

11、為灰度圖，就是通過(guò)image - type - 8-bit這一步。如果把黑-灰-白連續(xù)變化的灰度值量化為256個(gè)灰度級(jí)，灰度值的范圍也就為0-255 ,表示亮度由深到淺。G57414S1 5014G從上圖我們可以得知純黑為0,純白為255,中間0-255代表各個(gè)不同亮度等級(jí)。而通常我們所得到的WB圖片是這樣的:r _ 前者A是沒(méi)有轉(zhuǎn)化為灰度模式的，后者B是灰度模式下的。而在灰度模式下，如果按灰度值描述的話，顯然有明顯條帶的的灰度數(shù)據(jù)基本都與0相近，數(shù)值很小,這樣不利于互相比較。所以通常的做法是進(jìn)行“反相”，也就是將白的地方變?yōu)楹?，黑的地方變?yōu)榘祝伾嵉?。也就是這樣：照片底片，記不記得底片上人

12、物的頭發(fā)都是白的發(fā)亮，這種就是灰度值255哦；還有做電泳凝膠的小伙伴，得到的凝膠圖就不需要反相了，可以直接進(jìn)行灰度值分析哦）。我們目前要想測(cè)量條帶的灰度值，就只需把那發(fā)光發(fā)亮的地方圈出來(lái)，讀取灰度值就可以了，而這一部分就交給photoshop來(lái)計(jì)算吧。在這里小石頭想敲敲黑板，提醒大家注意下三點(diǎn)：1、由于Photoshop得出的灰度值是平均灰度值，而在比較 WB條帶灰度值時(shí)，我們還應(yīng)考慮面積的關(guān)系，以面積與平均灰度相乘得出的總灰度，我們才能更準(zhǔn)確地得出條帶之間的表達(dá)差異。2、條帶上得出的數(shù)據(jù)其實(shí)是相對(duì)于背景而言的，這個(gè)背景雖然反相之后非常黑了，但畢竟不是全黑的，我們還需要扣除背景的灰度值。并且，

13、背景盡量干凈，這就要求我們?cè)谧?WB時(shí)多努力了。3、不同圖片的背景是不一樣的，不同圖片的 WB條帶是不能進(jìn)行相互比較的哦。接下來(lái)附上 Photoshop 測(cè)量 WB條帶的灰度值的操作方法，其中每一步的意義基本已在上文所介紹，對(duì)哪一步操作有不明白的小伙伴可以回過(guò)頭再看看的。步驟1 :打開(kāi)軟件 Photoshop一左上角打開(kāi)圖片步驟2:將圖片轉(zhuǎn)為灰度模式（如果已經(jīng)為灰度，此步跳過(guò)）：圖像一模式一灰度一扔掉步驟3:將條帶擺正（兩種方法）通用步驟：最左側(cè)選取標(biāo)尺工具一在條帶上畫(huà)一條自認(rèn)本應(yīng)水平的線d限M工X30科叵眩售工月金燈酥色H5?擇器工與HTWW 尺工工G注神工具心？計(jì)蝴工具方法一：直接點(diǎn)擊正上

14、方“拉直圖層”（此操作簡(jiǎn)便，但有可能使邊緣條帶挪出 界外）Adobe Photoshop CC 2017 t比例拉亶圖層清除X img014.tif 50%（灰色/8） *方法二：圖像一圖像旋轉(zhuǎn)一任意角度一確定步驟4:得到的灰度圖進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整：圖像一調(diào)整一色階一調(diào)整下圖中三個(gè)點(diǎn)，適當(dāng)將自己的 WB圖片轉(zhuǎn)成黑白對(duì)比稍明顯的樣子，如圖（此步也可通過(guò)更改亮度/對(duì)比度實(shí)現(xiàn)：圖像一調(diào)整一亮度 /對(duì)比度）步驟5:反相：圖像一調(diào)整一反相步驟6:最左側(cè)多邊形套索工具一延條帶邊緣圈選一圖像一分析一記錄測(cè)量析一選擇數(shù)據(jù)點(diǎn)可以只顯灰度值-平均值和面積），依此步依次測(cè)量各個(gè)條帶，同樣 的方法選取任意一個(gè)背景測(cè)量背景灰度值。步驟7:導(dǎo)出數(shù)據(jù)，進(jìn)行處理IlliZJ5r 3 門(mén)AaGDf半加酊用 MH超魔'寶麗而*4aS7V2711 ?f 4口26»0丈 _ _ 巴壟蛔里ij,aKUZ2»£01 CD3WI4I- -ni?MT/，TdUH<lI及皿編4H3 e 口加他11益融通1O37